抄的哦

1 实验室安全

1.1 微生物实验室的生物安全性

1.2 科室安全文档

（a）生物危害防护：实际操作规程见（《实验室生物安全通用要求》，中华人民共和国国家标准GB19489-2004。2004-01-05发布，2004-10-01实施。）

（b）实验室安全：原则和措施见（《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，中华人民共和国卫生行业标准WS 233-2002。2002-12-03发布，2003-08-01实施。）

1.3 应用：

以上的操作规程应用于微生物科室的所有部门。工作人员或访问人员必须遵守各项规定。

1.4 关于新规定或现行规定的修改案：

任何新规定或现行规定的修改案必须通知负责科室安全的人员及相关人员，他们将建议科室主任考虑实施。

1.5 生物性危害

1.5.1 与各种操作有关的生物危害水平取决于：

a.处理的传染性物质的本身：

按照传染性物质对个人和社区和潜在危险性以及经空气传播的可能性，其划分成不同等级。所采用的等级划分详见”《实验室生物安全通用要求》”；原则和措施（见《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》）。

b.使用的设备和设施：

处理不同等级的传染性物质的要求在”实验室安全”中已规定。这些符合要求的设备都要承担重要临床工作，科室负责人必须保证中应污染物水平。

c.培训，特别是员工的安全性培训和安全性经验积累。所有员工应该接受一定训练，能安全处理任何实验室可能碰到的物质，避免将实验不能处理或规定之外的传染性物质暴露在实验室，即使暴露事故在实验室，即使暴露事故发生也要会正确处理。

1.5.2 传染性物质的分类

1.5.2.1分类系统

生物危害防护：〔见1.2 (a)〕，根据生物因子对个体和群体的危害程度将其分为4级，危害等级Ⅳ最具危害性。

1.5.2.2危险群/生物安全水平：1－4

a.危险群/生物安全水平：1——对健康成人无致病性，对社区无危害性。通常一般微生物操作就足够，不需特殊安全设备，工作的附近要有洗手设施。培养基上包含未鉴定物，因此，妥善处理对各级安全水平都至着重要。

b.危险群/生物安全水平：2——人类疾病相关物质，这种物质对实验室工作人员有中度危险，并具有一定程度社区危险性。医院微生物室所涉及的绝大多数物质属此安全水平，生物危害警告应张贴，并且限制接近，应用醒目标语，若是能产生空气传播或飞溅的I，II类物质都就使用相就的操作台。实验室就提供类似防护衣和手套，眼罩尤其是配戴隐形眼镜者，也应提供类似安全水平的洗手设施，并且临近工作区也应有高压灭菌装置。所有废物和反复使用设备的去污染应有特定的程序。

c.危险群/生物安全水平：3——人类疾病相关物质，具有潜在空气传播性，能引起严重，致命疾病，对实验室工作人员高度危险，并具有一定程度社区危险性。所有含有或怀疑含有生物案的标本必须标以”小心污染”标签，并且同时标于盛放标本容器和申清单。然而作为预防保护还不足够。应对所有血液，体液，分离的人体组织等有普通防护意识，它们都应视作传染源。在此生物安全级，实验室应控制对其接近。凡涉及该类物质都应使用I或II类工作台操作，也可以遵循II级操作注意事项，对所有废物进行去污染处理，包括工作服和重复使用设备。

d.危险群/生物安全水平：4——对个人的危险如生物安全3级，但对社区有高度危险性。这些传染性物质包括：

蜱源性脑炎病毒

支里半亚－刚果牛血热病毒

Marburg Virus

艾波拉病毒

Lagsa fever Virus

Junin HF Virus

Machupo HF Virus

Guanaruto HF Virus

Herpesvirus simiae (B Virus)

1.6 以下预防措施，所有实验工作人员必须遵守：

1.6.1 工作服

a.所有实验室成员在工作期间必须始终穿着所提供的工作服。离开实验室时，工作服须挂在指定地方，不得在实验室外冼工作服。

b.在处理含有或怀疑含有生物安全3级物质的标本时，必须在工作服外穿隔离衣。

c.在生物安全操作台内处理标本和培养基时，必须戴手套。

1.6.2 洗手池

洗手池须供应洗洁剂和纸巾。

1.6.3 洗手

所有工作人员在离开工作区必须洗手，并且要先脱去工作服和手套。

1.6.4 食物，饮水，吸烟，化妆品

食物和饮料不允许带入任何处理标本的房间.不允许在处理标本的任何地方吸烟.不允许在处理标本的任何地方使用化妆品。

1.6.5 伤口和擦伤

手上的伤口和擦伤必须覆盖保护物。

1.6.6 个人衣物

个人衣物不允许带入实验室，并且必须保存在带锁的柜子里。

1.6.7 口吸移液管

这是禁用的。要求使用机械移液装置。

1.7 常规预防措施应用于所有血液、体液、组织标本的操作中：

1>无论何时都应尽可能避免使用注射器，针头或其它锐器。

2>使用过的针头和一次性切割器必须丢入专门的带有盖子和桶内，以备安全处理、防止容器过满盛装。

3>使用过的针头不许重新使用或再用手操作。

4>打烂的玻璃必须放入坚硬的容器（不要用手），然后再放入黑色垃圾袋，如果是污染的，使用黄色垃圾袋。

5>在接触具有潜在性传染性标本培养基、组织，必戴保护性手套，防止皮肤直接接触。如果手套有可见的污染，必须先除去污染，再更换。手上有皮炎或伤口的工作人员的需要间接接触传染性物质的人员应戴保护性手套。

6>在处理完标本、结束工作，甚至在上述规定带手套时，应常规洗手。

7>当血液、血液制品或其它体液污染发生时，应停止工作洗手，戴一次性手套再清除污染区。建议用含有效氯1000ppm的次氯酸钠溶液。如果污染区较大用浸有次氯酸钠溶液的湿布覆盖10min去污染，并标示相应的警告，丢弃废物及手套到生物安全级物理容器。注意飞溅的水滴和流淌会将污染带到主污染区以外。

8>所有在实验室使用的具有潜在污染性的物质都需去污染，最好先高压，再做处理。

9>任何可能产生飞溅或气雾的操作都应在生物安全操作台里进行。这些操作包括离心，分离血清，混合，超声，收集组织受精卵，以及处理含有浓集的感染物质标本。

1.8 实验室物质处理

a>黑色塑料袋用来收集未污染或经高压过需处理的废物。

b>废纸屡用来收未污染的废纸，用过的纸巾等。

c>所有可能传染的物质必须高压或焚化。

d>所有丢弃的标本，培养基和实验室废物必须放在专门容器里

e>用白色聚丙烯罐盛装2%新鲜配置次氯酸液，以供工作中丢弃标本，污染吸头，棉拭子临时处理待一天工作结束之后，再经高压处理。

f>黄色塑料袋用来处理污染的实验室废物。它们应封口再由工人拿去焚烧。

g>带盖，带标签硬质容器用来盛装针头的锐器。

1.9 实验室传染性物的消毒

高压

a.所有培养基的传染性物质都要高压，除非准备焚烧的，高压的最大好处是使传染性物质离开实验室可保证安全。

b.用作此目的的高压设备应在医学技师监督下由实验室工人操作。

c.高压设备应定期由医院设备组测试，检修。这些测试包括商业使有的芽胞试纸实验。多个高压设备应有使用记录，并自使用之日起由医学技师连续记录。任何不符都要向安全人员报告。

1.10 去污染

去污染剂：

1>次氯酸溶液：用白色聚丙烯罐装新鲜配置的含有效氯1000ppm的2％次氯酸溶液，放在多个工作室。

2>5%的Printol：其50％水溶液用来处理溅在地板和家具上的污染。

3>戊二醛：新鲜配制成一定浓度，主要用于不能使用次氯酸钠的仪器去污染，如离心机等。

4>75％乙醇：主要用于对清洁表面的快速去污染。

1.11 离心机

1.11.1 注意事项：

a>使离心机用的试管应具是厚管或塑料的，离心前应仔细检查是否缺损。

b>离心机需放置在合适的位置，操作都应能看见离心缸，以便能正确地将离心架放在转子上。

c>离心桶和离心架配对使用，负载后需仔细平衡。

d>为避免脱架和试管内溶液溅出，开始采用低转速，然后逐渐升高。

e>离心机内缸应由高级人员定期检索，内壁必须用戊二醛定期清洁，去污染。

f>在对含有或怀疑含有生物安全操作3级标本离心时，必须加盖密封，密封盖只有在一级生物安全操作台内才能打开。

1.11.2 离心时，试管破裂

a>如果正在离心时，发生或怀疑发生试管破裂，电动机应立即断电，并在30min后才能打开离心机盖。

b>如离心后发现破裂，应立刻关闭机盖，保持至少30min。

c>立即通知安全员。

d>戴厚手套，使用镊子或用镊子夹棉鉴清除破碎玻璃碎片。

e>所有破裂试管，玻璃碎片，离心桶和转子必须放在专门消毒剂中去污染，要求消毒剂不具腐蚀性，对浸生物安全物质有效。然后，或者浸泡至24小时，或者高压。

f>未破裂，带盖的试管也应放在另一含有消毒剂的容器中1后，再对其内容物处理。

i>离心缸必须用戊二醛棉拭子清洁，过夜，再重复擦拭，再用水清洁洗净并干燥。

g>含有生物安全3级物质的密封离心桶必须在密封状态下取出，在一级生物安全操作台内打开。如果试管破裂，离心桶密封盖应松松地盖上，对离心桶高压。

1.12 破裂和溢出

任何重要的破裂的溢出都应通知安全人员。在处理含有或怀疑含有生物案例的溢出物，应先得到安全人员的建议。

1.12.1 病毒培养基的泄漏

a>用浸有20％次氯酸钠的纸巾覆盖溅洒出的污染物用容器碎片。

b>覆盖10－15min。

c>戴一次性手套，清扫纸巾和碎片于合适的容器（如塑料袋，但不包括含有碎玻璃或其它锐利物体），用一片硬纸板去清扫，不能用刷子或尘掸，除非它们适于高压。手指远离碎玻璃。

d>将碎片和使用后的废物放在实验室废物箱。

e>用常规工作消毒剂擦拭污染区及其周围可能飞溅区。

1.13 泄漏的标本

实验室不泄漏的标本，但要以塑料密封后退还到病房。

1.14 紫外线消毒：培养基，试剂分装和病人血清应存放－70°C和－30°C冰箱。操作存放于－30°C或以下温度冰箱物质，应戴手套，例如当标本从低温冰箱取出或放入时。

1.15 生物安全柜（台）

实验室应配备II级生物安全柜。

1.15.1 级别

I ：基本要求：定向流动保护，要求气流从外流入安全柜，并且远离操作者，指向传染物。经HEPA过滤排后，紧好由导管引向室外，以便清除去污染后的各种蒸汽。

II：基本要求：经过滤气体垂直流向，既保护操作者也要保护工作不受污染。

IIA：70％的过滤气体重新循环至工作区，废气导向室外经HEPA过滤。和内流经式工作区的气流速度平均0.4m/s或略高。

IIB：流进气体流速平均0.5m/s或更好。按照不同型别（IIB1，IIB2，IIB3），气体排出比例从70％到100％。根据工作选择不同型。如有毒化学物质和放射线同位素不能再循环至工作区。

III ：基本要求：操作者与传染物安全隔离，并且整个操作过程都要提高。安全柜所在的环境也要一定程度隔离，以防手套破裂。

1.15.2 生物安全柜的安装

安全柜要发挥某安全防护功能必须注意安装位置，废气应通过管道以保护环境不受污染。如果需购置这类设备应联系CUHK安全办公室，在种类，牌子，样式，安装位置和安装以及与其它设施的相邻关系上获得指导。

1.15.3 常规检查和安全操作以及工作区的消毒

有一份操作规程详尽地叙安全柜的常规使用也应包括安全柜发生意外时应采取的行动。每一个使用者必须阅读规程使后签名。

1.15.4 注意：

安全柜应尽可能避免使其处于不安全状态，但有时因为安全柜的意外，使用者被迫这样做。此时，应张贴注意以警告其它人不得再使用。

1.15.5 去污染和再认证

由受过训练的人员,配戴个人防护用具,来做污染工作。要求：安全柜在密闭条件下用干燥多聚甲醛蒸汽醺蒸，使用浓度8500ppm。（安全柜的体积应包括外周供应和废气过滤设备。）在温度20－25°c，相对温度不低于60％环境保持4h，甲醛蒸汽，如果允许，可直接抽出室外，若不允许可在安全柜内用氨基重碳盐吸收。

因为空气有限的穿透力，在处理潜在传染性物质时最好使用HEPA过滤器，以及高压或焚化后再丢弃。

1.17.5.2 再认证

这项工作由专门人员进行，去污染后安全柜性能再认证定，及过滤器的更换，测试是否有漏气，调试空气流速是否合规定，以及检测过滤器的性能。再认证应至少一年做一次，或是装置移动，过滤器维修后。应备有去污染，维修和再认证的记录，并且应方便使用者的查阅。

2. 实验安全操作程序：

2.1 工作人员在采集标本过程中应当防止病原微生物扩散和感染，并对标本的来源、采集过程和方法等作详细记录。

2.3 实验过程中绝对禁止吸烟、饮食等，不要以手抚头面部等。

2.4 处理样本的过程中易产生高危害气溶胶时，要求同时使用适当的个人防护装备、生物安全柜和/或其它物理防护设备。如可产生含生物因子的气溶胶，应在适当的生物安全柜中操作。细菌的分离培养、菌种开封、转种、研磨、稀释等操作，均应在生物安全柜中进行。

2.5 使用接种环进行操作时，接种环应在工作灯的内焰中燃烧，以避免菌液或菌块飞溅。

2.6 稀释菌液时，吸管、针管要缓慢插入试管或烧瓶底部，小心操作避免产生气泡或气溶胶。

2.7 使用注射器加样时，用过的针头切勿再重新入套或拔开注射器与针头，应直接放入锐器收集器，以免划破皮肤造成接种感染。

2.8 菌株库要设专人管理，并按照国家微生物菌毒种管理办法执行。2.9进行毒菌操作过程中，不要穿戴巳经污染的防护性手套触摸门柄、仪器或毒菌区以外区域，避免由于粗心扩大污染范围。

2.10 试验结束后，操作过程中所有可能与生物危险物接触或被污染的试验器械和物品，能够高压消毒的必须高压消毒，不能进行高压消毒的设备、仪器，应使用有效的消毒剂擦洗后再以紫外灯近距离长时间消毒。

2.11 实验中发生意外污染情况，应立即通知主管人员并做好处理污染物和相应区域的准备，不得擅自采用其它禁止的方法进行消毒处理。

2.12 实验室内任何微生物的样本，废弃物都必须经高温高压灭菌后，方可按一般垃圾处理。

2.13 实验室所用任何个人防护装备应符合国家有关标准的要求。实验室应确保具备足够的有适当防护水平的清洁防护服供使用。还应穿戴其它的个人防护装备，如手套、防护镜、面具、头部面部保护罩等。

3. 实验室污物处理及消毒操作程序：

3.1 实验室含有生物危险物的临床标本及被污染的一次性用品，试验完成后，应在操作台或实验区域内以紫外灯近距离照射消毒 2小时以上，再经高压消毒后方可丢弃或焚烧。

3.2 可重复使用的实验用品及器材，完成实验后，应在操作台或实验区域内经紫外灯近距离照射消毒2小时以上后，再交有关人员进行高压消毒和煮沸洗刷。

3.3 实验用的试管、吸管、注射器，须装在加盖不漏的容器内，经高压灭菌后取出。

3.4 培养物或实验室垃圾，在丢弃前必须经高压消毒和紫外灯近距离长时间照射处理。不允许积存垃圾和实验室废弃物。已装满的容器应定期运走。在去污染或最终处置之前，应存放在指定的安全地方，通常在实验室区内。

3.5 实验室废弃物应置于适当的密封且防漏容器中安全运出实验室。有害气体、气溶胶、污水、废液应经适当的无害化处理后排放，应符合国家相关的要求。

3.6 实验过程中，如标本或含标本的前消化处理液被打翻污染了操作台或地面，应以吸满70%酒精的卫生纸覆盖污染区，15分钟以后卫生纸方可移去。

3.7实验室内未经消毒的污水，禁止直接排入公共排水系统，更不允许混入居民生活垃圾。

4. 意外事故处理程序：

4.1 如果发生意外，必须立即通知实验室主管人员和医院生物安全办公室，并在有关人员的指导监督下对出事现场进行处理，绝对禁止未经报告而私自对出事现场给予非规范的处理。

4.2 实验过程中，如污染物溅落到身体表面，或有割伤、刺伤、烧伤、烫伤等情况发生，应立即停止实验工作进行紧急处理，更换被污染的实验服，皮肤表面用消毒液清洗，伤口以碘酒或酒精消毒，眼睛用无菌生理盐水冲洗。

4.3 如果发生菌液溢出，含菌种的培养管破碎等，造成中 、小面积污染，可用比污染面积大25%以上的纱布覆盖污染区域，边缘用脱脂棉围住，向纱布倾倒5%苯酚溶液或70%的酒精，浸泡2小时以上（其间适量加溶液防止干燥），再经紫外灯近距离（1米内）照射2小时以上；被污染的器械、容器等立即浸泡于70%酒精中2小时以上，再次着防护衣进入房间，将污染溢出物和用于清洁的纱布放入可耐受高压的双层塑料袋内并尽快高压。

4.4 如果发生气溶胶污染或大面积污染，应立即停止实验并关闭实验室，对污染区域进行紫外灯照射消毒过夜；第二天对污染区进行24小时封闭空气熏蒸消毒（乙醛消毒法：5ml乙醛＋2g高锰酸钾/m3空间）。

4.5 临床医务人员应对事故受害者和消毒人员进行医学随访。

实验室要培养大肠埃希菌中海麦康凯液体培养基的可以对该细菌进行培养、复壮和增菌吗？

麦康凯液体培养基增菌培养超48小时还以划平板。培养基的保质期各不相同。不同的标准明确规定了保存条件和保质期。培养基应保存在环境中，以防止其成分发生变化，即应避光和干燥。如有必要，保存在2℃～8℃在冰箱中，或根据培养基要求的储存条件进行保存。除标准规定或保质期验证结果表明保质期较长外，平板保存一般不超过2周~4周，三角瓶和试管保存时间不超过3个月~6个月。

跪求请问谁知道大肠杆菌在保健食品中的标准值是多少？我可以向那里咨询？

可以使用麦康凯液体培养基对细菌进行培养、复壮和增菌，该培养基的用途：用于大肠埃希菌选择性增菌培养

成分(g/L):

明胶胰酶水解物 20.0

乳糖 10.0

牛胆盐 5.0

溴甲酚紫 0.01

pH7.3±0.2

25℃

检验原理：

明胶胰酶水解物提供碳源和氮源满足细菌生长的需求；牛胆盐可抑制革兰氏阳性细菌的生长；乳糖是大肠菌群可发酵的糖类；溴甲酚紫是pH 指示剂，酸性呈黄色，碱性呈紫色。

近年来，在政策的支持下，我国生物制品产业发展势头强劲，资本投入持续增加，在部分产品领域逐渐实现进口替代。作为生物制品的关键原材料，受生物制品产业快速发展的推动，细胞培养基行业规模持续扩大。根据新思界发布的《2021-2025年中国细胞培养基行业市场行情监测及未来发展前景研究报告》，2020年，中国细胞培养基市场规模达到了40亿元以上。但是，中国细胞培养基产品绝大部分依赖进口，对我国生物制品行业的健康发展造成了不利影响。

细胞培养基产品对外依赖度高主要是由于该产品技术壁垒高，国内起步晚，研发经验积累不足，导致产品开发进程缓慢。细胞培养基制备与应用涉及生物、化学、物理、医学等多门学科知识与前沿技术，配方一般包含70-100种不同化学成分（包括糖类、氨基酸、维生素、无机盐、微量元素、促进生长的因子等），需要通过分析细胞特性和工艺试验确定适合细胞生长的配方组份，往往需要反复、大量的实验论证及科学分析。

且不同应用领域的用户对细胞培养基的配方有着非常强烈的个性化需求，这就导致细胞培养基产品的研发需要投入大量的人力、物力、财力以及时间，因此虽然近年来进入该领域的企业及研究机构数量持续增长，但是实现规模化生产的极少，

相关网站:http://www.foodmate.net/

大肠杆菌O157: H7实验 诊断研究进展

大肠杆菌O157: H7感染临床表现

出血性肠炎：鲜血样便，腹部痉挛性疼痛，低热或不发热。

溶血性尿毒综合征（HUS）：主要发生在儿童，常出现在腹泻后数天或1-2周。病死率一般在10%，各别可高达50%。

血栓性血小板减少性紫癜（TTP）：主要发生在成年人，尤其老年人。病人主要表现为发热、血小板减少、溶血性贫血、肾功能异常等症状，病情发展迅速，病死率高，有时可出现70%的病人死亡。

大肠杆菌O157: H7传染源和传播途经

大肠杆菌O157: H7基本上是一种食源性病原菌，可通过食用大肠杆菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或制品、鸡肉、蔬菜、水果、饮料、水等感染,也可通过人与人、人与动物密切接触传播。

在实验室，大肠杆菌O157: H7可以感染小鼠、鸡、兔、猪、牛等动物。

大肠杆菌O157: H7的感染已成为世界性的问题

我国情况也不容乐观

一、细菌培养与鉴定

1．分离培养

早期培养对确定病原有重要意义。

培养的对象首先是急性血性腹泻患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接触者。

培养基：

山梨醇麦康凯琼脂、胰胨大豆琼脂

改良的伊红美兰 、改良的SD-39（MSD）琼脂

添加了头孢克肟 和 亚碲酸钾的山梨醇麦康凯琼脂（TC-SMAC）

添加了头孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麦康凯琼脂（CR-SMAC）

“科玛嘉”大肠杆菌O157: H7显色培养基

四溴荧光亚甲基兰琼脂

H7抗血清—山梨醇发酵培养基

增菌液：

含10mg/L 新生霉素的EB肉汤或肠道增菌液

含10mg/L 新生霉素或10mg/L盐酸-吖啶黄的胰蛋白胨大豆肉汤

新生霉素MEC肉汤

月桂基胰蛋白胨肉汤

加入下例任何一种抑制剂均可增加培养基的选择性

头孢克肟 0.05mg/L 亚碲酸钾2.5mg/L

新生霉素10mg/L 万古霉素40mg/L

2．免疫磁珠分离法

免疫磁珠分离法是将特异性抗体吸附于一种能被吸附的磁性珠子上,然后利用抗原抗体反应特性将样品中的大肠杆菌O157: H7富集起来。

方法:1.增菌2.取样品1ml加大肠杆菌O157: H7免疫磁珠20ul3.轻轻混合10分钟4.将试管插入磁架上5.吸取上清6.加PBS,重复3-5过程7.取管壁沉淀物,划线接种于CT-山梨醇麦康凯琼脂(C-头孢克肟,T-亚碲酸钾)等选择性培养基。37℃培养6-24小时，挑取可疑菌落进行鉴定。

Chapman等 共检测大便标本690份, 免疫磁珠分离法检出25 。用免疫磁珠分离法分离的l2株大肠杆菌O157: H7中,直接培养阳性仅5株。

Wright等将接种大肠杆菌O157: H7的碎牛肉标本置加有万古霉素和头孢克肟的缓冲蛋白胨水培养,然后直接或用大肠杆菌O157抗体包被的磁珠分离细菌后,接种于CT-SMAC,结果直接次培养检出量为200cfu/g,而免疫磁珠分离法仅需 2cfu/g 。

Chapman等先用EC肉汤增菌,然后用免疫磁珠分离法富集牛粪便大肠杆菌O157: H7菌株,再用选择性培养基分离，并与CR-SMAC和CT-MAC直接培养作比较。用前者检测接种12株不同大肠杆菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。

Cubbon等用免疫磁分离法（IMS）检测牛粪便和食品标本的大肠杆菌O157: H7。在一起经牛奶传播的大肠杆菌O157: H7爆发中,用IMS、粪便培养和多聚酶链反应(PCR)检测Vero毒素基因的携带,用三种方法对粪便大肠杆菌O157: H7的分离率作比较结果,在受检的142份粪便标本中,直接培养和IMS均阳性20 份,另13份仅IMS阳性。因此,IMS提高了大肠杆菌O157: H7感染病例的检出率,与PCR符合率高。

目前，污染的肉、家畜，甚至饮用水均面临大肠杆菌O157: H7的卫生威胁。检测食品和水源中肠道病原体使用传统的培养法,结果不理想。IMS和其它检测的研究表明,对快速检测食品和环境标本似乎前景良好,Yu检等以IMS结合电化学发光检测法(ECL)检测食品和污染物中的大肠杆菌。结果显示,在原缓冲液检出大肠肠菌的范固为100－1000 cfu/lm,在食品检出的范围为1000－2000cfu/lm ，检测时间十分快,一般不到1小时。菌O157: H7菌株的牛粪便悬液,其敏感性比在两种培养基上直接培养高100倍。在监测牛群的4个月间,从牛采集1024份直肠标本,其中检出大肠杆菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培养和IMS分离。23份中15份由两种培养基、5份仅由CT-SMAC、3份仅由CR－SMAC分离,其余61份(72.6%)仅IMS分离。用含吐温－20 的PBS洗涤磁珠可减少其它微生物与磁珠的非特异性结合。用无关的抗体包被磁,则大肠杆菌O157: H7不结合。IMS具有快速、操作简单、特异性高,在流行病学调查中有价值。

3．生化反应

目前许多国家使用的O157和 H7特异性抗体与极少数细菌具有不同程度交叉反应。因此用生化试验确定为大肠杆菌是必须的。

典型大肠杆菌的主要生化反应结果如下：

动力试验（+） 葡萄糖（+） 麦芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氢（－） 尿素（－） 靛基质（+） 甲基红（+） V-P试验（－）枸橼酸盐（－）苯丙氨酸脱羧酶（－）赖氨酸脱羧酶（+/－）鸟氨酸脱羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化钾（－）

与O157有鉴别意义的生化反应见表1。

MUG即4-甲基伞形化内酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多数大肠杆菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG产生荧光, 但O157: H7中大多数菌株则不水解MUG。Thompson等建立了一种快速MUG试验,取 MUG试剂0.5ml置试管中,以无菌棉签挑取待检菌纯培养物混匀于其中,44.5℃置20min,暗室内高强度光源下观察结果,产生蓝色荧光者为阳性。

二．血清学检测

1．玻片凝集试验

2. 胶体金免疫技术

3. ELISA

4．免疫荧光技术

5．胶乳凝集

6. 间接血凝分析(IEHA)

7. 全自动抗原抗体检测系统

8. 免疫印记法

1．玻片凝集试验

玻片凝集试验是鉴定O抗原最经典的方法,实验中如果凝集反应不明确，但根据临床表现和生化反应等菌株高度可疑时,可100℃加热菌液30min再行玻片凝集试验。这样可去除K抗原的影响。为排除交叉反应引起的凝集造成假阳性,应继而做试管凝集反应,所测得的效价不应低于诊断血清原标定效价的一半。鉴定H抗原也应同时做玻片和试管凝集试验,并应先对待检菌做动力试验,在动力活泼时取培养物做H抗原鉴定。

2. 胶体金免疫技术

胶体金免疫技术特点是以胶体金作为标记物进行的抗原抗体反应。这一技术最初用于免疫电镜技术。至今，在免疫测定中，金标记常与膜载体配合，形成特定模式，典型的如斑点免疫渗滤试验和斑点免疫层析试验等，已是目前应用广泛的一种简便、快速的血清学检验方法。

胶体金的制备多采用还原法，氯金酸是主要还原材料。金颗粒的大小取决于制备时加入的柠檬酸三钠的量。

胶体金免疫层析试验时以硝酸纤维膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析一样。

中国预防医学科学院微生物研究所利用胶体金技术、双抗体夹心法和显色反应等特点，研制了大肠杆菌O157: H7病原体快检金卡，通用于定性检测粪便、食品、水等样品中的O157: H7大肠杆菌。显色程度与样品中细菌含量成正比，最低测菌量为少于100个菌细胞，主要特点是敏感性高，可用于待检样品初筛，阳性样品可进行细菌分离，减少工作量。

3. ELISA

大肠杆菌O157: H7的常用检测方法是粪便培养后作细菌分离,然后用生物化学和免疫学方法鉴定,一般需72 小时。

Dylla等用一种快速ELISA直接检测粪便中大肠杆菌O157: H7,并与标准培养方法加以对照。结果显示,ELISA检测183份粪便标本,检出大肠杆菌O157: H7 9份。常规培养法阴性176份,而ELISA阴性174份。总特异性为98.9%。该法与其它非O157: H7大肠杆菌无交叉反应,是一种准确、敏感、特异、易观察结果的筛选方法，尤其适用于中、小实验室及大量粪便标本的流行病学调查。

Padhye等用单克隆抗体进行直接ELISA反应检测O157: H7,除O26 ：H11外，未发现与沙门氏菌、结肠炎耶氏森菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反应。单克隆抗体用于检测大肠杆菌O157: H7有明显特异性，可作为一种免疫试剂用于临床和食物标本的快速检测。Clark 等近一步对单克隆抗体的研究发现,此种单克隆抗体识别的物质是LPS,这种LPS抗原决定簇用全细胞ELISA同样可以在其它血清型大肠杆菌和产生或不产生Vero毒素的大肠杆菌中检测到, 而且易受到胆盐、吖啶黄和温度的影响,但可以通过结合免疫捕获的修饰方案来提高ELISA的特异性。

4．免疫荧光技术

DEFT 与Ab-DEFT：

直接荧光技术（DEFT）与抗体定位荧光技术(Ab－DEFT)的主要特点是,显微镜下直接计数样品菌细胞。由于无需培养或分离过程,因此检测非常快速。DEFT的基本原理为:对样品进行过滤,用荧光染料(如吖啶橙)对留在滤膜上的菌细胞染色后,用荧光显微镜观察计数。但由于荧光染料的非特异染色,不但被检菌被染色,本底杂菌也可染色,从而影响了结果的精确性。Ab-DEFT则克服了这一缺点,过滤后的菌细胞与荧光标记的特异抗体作用,然后用荧光显微镜观察计数。

固相荧光毛细管免疫分析

此方法高度敏感，具有快速、试剂用量少、易于操作等优点。Czajlu等用热杀死的O157: H7菌包被玻璃毛细管作固形支持物。

样品中加入结合了生物素的O157: H7多克隆抗体,作用一段时间,然后将此样品/抗体混合物与标记了Cy5 (一种荧光花青染料)的亲和素加入到毛细管,孵育2min,冲洗、吹干,由激光传感器系统发射650nm波长激发光激发花青染料,之后用光学传感器系统测定荧光发射密度。

直接免疫荧光抗体染色

Park等对粪便样品进行离心后,用免疫荧光抗体对粪便涂片进行标记,可检测到所有培养法证实的菌株,检测时间<2h。

5．胶乳凝集

该方法是以胶乳颗粒作载体,以O157: H7特异性抗体致敏,制成特异的胶乳试剂,将标本乳化于玻片或有色烧盘上，滴加胶乳试剂,呈明显凝集而对照胶乳不凝集时即为阳性。

6．间接血凝分析(IEHA)

该法多用于对LPS、可溶性本体抗原、未加热抗原的抗体检测,对检测H抗原的抗体效果不佳。Morooka等检测了溶血性尿毒综合征(HUS)病人血清LPS抗体,虽然甲醛化羊红细胞(SRBC)有低水平非特异性吸附,但不影响该方法作为一种有效、快速（<3h）的诊断方法。因为感染病人血清的滴度明显高于非特异性吸附。

7. 全自动抗原抗体检测系统

VIDAS是一种全自动抗原抗体检测系统。可直接从感染性疾病患者标本中检测细菌、病毒、弓形虫、衣原体和螺旋体等微生物的抗原、抗体或毒素。

基本原理：采用酶联免疫（夹心法）原理，并在底物中掺入荧光物质，最终产生荧光产物4-甲基-7-羟刀豆素，荧光强弱与标本中被测物浓度相关，经扫描样本读数与标准比较计算出标准值，并根据阴性和阳性临界值判定结果。

8.免疫印记法

目的是检测大肠杆菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特异性 抗体。基本原理是将提纯的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后，通过转移电泳转移到硝酸纤维膜上，然后用抗原抗体进行免疫检测。包括SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、转移电泳、免疫检测三部分。

特点是具有比较高的特异性和敏感性 。

免疫检测

将封闭好的硝酸纤维素膜按梳子齿的宽度剪成每一个泳道一条，依次编号。

1) 每条加入1毫升用PBS稀释的病人血清，室温震荡2小时，同时设阳性对照和阴性对照；

2) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤3次，每次5分钟；

3) 加入用1毫升用PBS稀释的II抗，室温震荡1小时；

4) 用2.5毫升／条PBST震荡洗涤2次，每次5分钟，再用PBS洗涤一次；

5) 将膜放入12毫升显色液中显色，室温震荡15-30分钟，至阳性对照出现满意的蓝紫色 ；

6) 将膜放入蒸馏水中终止显色反应，照相；

7) 当显色的条带和溶血素的分子量或0157脂多糖的条谱一致时，结果判断为阳性。

二．分子生物学检测

分子生物学的出现，为更快诊断微生物提供了许多分子学工具。 这一新的研究是用基因型而不是表型因子来鉴定特异性病原体。因此其特异性更好。加之 操作程序自动化使得DNA分析在实验室应用中已成为常规操作。自动化DNA提取仪，聚合酶链式反应仪(PCR仪)，DNA序列分析仪，脉冲凝胶电泳仪(用于分离DNA大片段，如完整的染色体) 在疾病诊断中都是很有用的。

1．DNA探针

探针(probe)标记：放射性核素 、非放射性物质标记 。

探针的来源 ：①克隆的基因组DNA探针；②cDNA探针；⑧RNA探针；④寡核苷酸探针。

标本处理：根据标本来源和量的不同而处理不同 。

杂交方法：斑点杂交 、southern印迹 、原位杂交 、Northern印迹 等。

杂交信号检测 ： (1)测量放射性核素射线脉冲数 (2)放射自显影 (3)显色法 (4)发光法。

O157: H7特异噬菌体上的sltⅠ、Ⅱ基因、大质粒溶血素基因及染色体上eae基因等都已制成了可杂交检测的特异探针。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探针进行流行病学调查。Thomas等用地高辛标记的VT2B亚单位基因、VT2C基因探针检测不同噬菌体型O157: H7菌。Huck等筛选了O157: H7大质粒上限制性片段,发展了一种2.0kb的Sma I片段探针,认为此探针对O157: H7血清型最为特异,可与所有O157: H7试验菌杂交。

2. PCR技术

聚合酶链式反应技术（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。具有特异性强、敏感性高、快速、简便、可扩增RNA或cDNA、对起始材料质量要求低等优点。

PCR技术扩增体系的基本成分

引物: PCR产物的特异性主要取决于引物链的特异性。由于存在同源序列，随意设计的引物链，其PCR产物在电泳分析时可能出现多条链，因此在设计引物链时应充分考虑引物特异性。引物长度一般为15-30个碱基,G+C含量为40- 60%,浓度0.1-1umol/L 。

TaqDNA聚合酶：浓度为1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶单位用量增长可能导致非特异DNA扩增 。

模板DNA：应避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂及能结合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制备方法有加热法、冻溶法、超声波粉碎法、碱变性法、SDS裂解法等多种。

4×dNTPs ： dNTP储存液pH应为7.0，在反应体系中，4种dNTP的浓度应相同，每种dNTP的浓度以50-200 umol/L为宜。

缓冲液及其他成份：PCR反应体系中，一般采用Tris-HCl缓冲液。适宜的Mg2+浓度为高于dNTP总浓度0.2-2.5 mmol/L。

PCR技术循环参数

PCR扩增是由变性、退火和延伸三个步骤反复循环而实现的。确定正确的循环参数是PCR成功的保证。

循环参数

1．变性温度和时间

模板DNA和PCR产物的变性不完全，是PCR反应失败最常见的一个原因,在变性步骤，使温度达到双链DNA完全分离的变性条件是95 ℃ ，30s。对GC含量高的靶DNA序列，宜用较高的变性温度。在解链温度下，DNA的变性仅需几秒。但是，使反应管内达到解链温度需要一定的时间。原则上变性步骤应高温、短时，即要保证变性充分，又要保持聚合酶在整个反应中的活性。

循环参数

2．引物退火

引物退火的温度和时间取决于引物的长度、碱基组成及其在反应体系中的浓度 。对GC含量约50％，长20个碱基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火温度为55 ℃ 。在温度较高的条件下退火，可提高PCR的特异性。

循环参数

3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶将脱氧单核苷酸逐一地加到引物的3’一OH末端，引物延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步骤的时间则取决于目标序列的长度、浓度和延伸温度。目标序列越长、浓度越低、延伸温度越低，则所需的延伸时间越长；反之，目标序列越短、浓度越高、延伸温度越高，所需的延伸时间则越短 一般而言，每1000个碱基的序列，延伸时间1分钟便足够了。对于扩增100—300个碱基的短序列片段，可省去延伸温度这一步骤，而采用快速简便的变性、退火双温循环。这是因为TaqDNA聚合酶即使在退火温度下仍保持很强的活性，而延伸过程可在退火温度转变为变性温度的过程中完成。

循环参数

扩增产物长度 100bp 500bp 1000bp 2000bp

94℃变性时间（秒） 30 30 60 60

55℃复性时间（秒） 30 30 60 60

72℃延伸时间（秒） 30 38 120 180

一般作25-30个循环即可，进行最后一次循环时间、延伸时间增加5分钟。

PCR扩增产物的检测方法

PCR反应混合物经过循环扩增后，所需做的工作就是检测反应液中是否存在预期扩增产物及产物的特异性。目前已经发展了许多检测分析PCR扩增产物的方法。包括凝胶电泳、高压液相色谱、核酸探针杂交、探针捕获酶免疫分析、酶切图谱分析、单链构型多态性分析、核酸序列分析。

PCR技术类型

免疫PCR技术 原位PCR技术 不对称PCR技术

巢式PCR技术 反向PCR技术 逆转录PCR技术

复合PCR技术 彩色PCR技术 抗原捕获PCR技术

增敏PCR技术 酶标PCR技术 二温式PCR技术

锚定PCR技术 定量PCR技术 毛细管PCR技术

多重PCR技术 巢式或套式PCR技术

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用

(1)简单PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段为基础设计了一对引物,扩增产物为633bp的DNA片段。其退火温度为60℃－63℃, 应用煮沸法与基因释放法,大肠杆菌O157: H7检出限分别为25与38CFU/ml,检测时间为3h。

Thomas等用PCR扩增了slt基因片段。引物：

正链5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',

反链5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3’

其PCR产物由凝胶电泳测定,检测时间为ld 。

徐建国等根据O157: H7 特有的hlyA、B基因序列设计了PCR引物,产物为338bp。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用

（2）多重PCR:由于鉴定O157: H7血清型不能仅仅依靠简单PCR,近年来国外学者对多重PCR方法在大肠杆菌O157: H7的诊断价值方面进行了研究。Meng等同时扩增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其长度分别为633、210、484bp。此引物设计可有效区别O157: H7血清型与O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一个单一反应中同时扩增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa质粒保守序列,其产物分别为1087、227、224、166bp。严笠选用针对大肠杆菌O157: H7志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三对引物,在同一扩增体系中进行PCR,检测12株不同来源的O157: H7大肠杆菌及其它致病性大肠杆菌及沙门菌、志贺菌15株。结果复合PCR方法较单一PCR方法具有较高的特异性，12株O157: H7取得了稳定、可靠的阳性结果。能迅速、有效地与其它致病性大肠杆菌及沙门氏菌、志贺菌相鉴别。

PCR技术在大肠杆菌O157: H7检测中的应用

（3）原位PCR: kurokawa等不用培养过程,直接用原位PCR技术结合落射显微镜,在单细胞水平快速检测O157: H7 。

4.23SrRNA在大肠杆菌O157: H7分型、检测中的应用

传统的细菌分类方法主要依赖于细菌的形态学、代谢产物、酶活性和表面抗原等特征。随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，微生物检测进入了基因时代，以核糖体核糖核酸序列为基础的分类方法为微生物的鉴别提供了新的分子生物学方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA区间序列分析等等，它完全不同于传统方法，具有快速、简便、敏感和特异等优点。

23SrRNA基因特征：

原核生物的核糖体有三种大小（分别为23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全长序列的菌种数目已达250种。长度大约为3000pb。对许多细菌的23SrRNA基因序列分析发现，其序列的可变性比16SrRNA基因要明显，特别是亲源关系近的种系。利用这些可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分类鉴定。同时对已知23SrRNA基因序列分析也发现，在最初的520pb中有6个保守区域（5-10区域），并发现，这6个保守区域中6区段和10区段最保守，该序列在14个菌种中完全一致。

应用：

检测临床感染性疾病的病原菌 首先，将两条引物设计在保守区，成为通用引物，而在变异区中选择序列作为特异性探针，先用通用引物作PCR扩增，可筛选出含有病原菌的样本，再用特异性探针与扩增产物进行杂交，对目的细菌作出鉴定，达到诊断病原体及分型的目的。

鉴定特定细菌种属 目前认为，已发现的23SrRNA基因的IVSs具有种属特异性，可利用IVSs（插入序列）进行PCR扩增达到对某一种属细菌的诊断。

在流行病学方面的应用利用可变区序列的差异可对相同菌种不同菌株进行分析。为流行病提供依据。

除以上介绍的各方法外,常用的有效检测方法还有脉冲场电泳、随机扩增多态性DNA指纹分析、细胞毒试验等,在此不一一赘述。

大肠杆菌O157: H7的检验程序

样品 增菌6小时 磁珠浓缩

可疑菌落 山梨醇麦康凯琼脂

G染色 生化反应 血清学 毒力基因

大肠杆菌O157: H7实验室诊断依据

有下列情况之一具有实验室确诊意义：

1) 从腹泻病患者的粪便标本中分离出大肠杆菌O157: H7 ；

2) 经PCR或DNA杂交试验证实具有溶血素基因 及志贺样毒素基因；

3) 腹泻病患者恢复期血清抗O157LPS IgG抗体呈4倍升高；

4) 具有血性便的腹泻患者的急性期血清或恢复期血清，蛋白印记试验证实含有和O157LPS、EHEC溶血素或志贺毒素的特异性抗体．

小结

自从O157: H7被认识以来,对其基因的研究越来越细,已经探明了许多结构与功能基因,对其病因学、病理学及临床治疗方面均有很大促进作用。由于引起感染所需的O157: H7剂量很低,有必要发展一些灵敏度高的方法,用于快速有效地检测。另外,现已发现存在许多变异株,单用一种方法来检测往往是不够的。如发酵山梨醇的变异株用SMAC即不能检测到由于许多非EHEC(EPEC、霍乱弧菌、志贺菌等)也可产生SLT,故单纯检测SLT也会产生假阳性结果。因此对一个样品的检测需结合使用多种方法才能获得准确的结果。

第三章 大肠菌群测定

一、大肠菌群检验

(一)检验方法

(二)培养基

(三)检验时应注意事

二、大肠菌群的卫生学意义

大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。该菌群主要来源于人及温血动物粪便，一般多用来作为食品中的粪便污染指标。过去我国在大肠菌群的检验方面经验不多，对该菌群的认识也不够充分。1974年全国修订食品卫生细菌检验方法座谈会和1976年全国食品卫生标准会议建议以大肠菌群作为粪便污染指标菌，并提出进行有关大肠菌群方面的科研工作。为此，我们成立了大肠菌群科研协作组，对犬肠菌群的检验方法(包括快速检验方法)及其卫生学意义进行了广泛的科学研究和实践，取得了一定成绩，为制订大肠菌群检验方法提供了科学依据。

在这次修订l976年版食品卫生检验方法的过程中，大肠菌群科研协作组又于1983～1985年对大肠菌群检验方法进行了实验研究，并作了对比观察，同时对国内常用的大肠菌群快速检测方法也进行了研讨，为这次修订国家标准食品卫生检验方法微生物学部分中的大肠菌群测定提供了科学依据。

大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学方面的要求，提出来的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。其定义为：系指一群需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。有些科学工作者又用靛基质、甲基红、V～P、柠檬酸盐、硫化氢、明胶、动力和44．5℃乳糖分解等试验，将这群细菌再分为大肠艾希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。不论分法如何，对大肠菌群的判定，均应以上述定义为基础。

一、大肠茵群检验

(一)检验方法

1．乳糖发酵试验。以无菌操作采取样品，采取量及稀释倍数，依据国家或当地卫生标准要求及样品污染情况而定。将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在l m J以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，lm1及1mI以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种3管，置36±l℃温箱内，培养24±2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。

2．分离培养。将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±l℃温箱内，培养18～24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。

3．证实试验。在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落l～2个进行革兰氏染色

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