溴化氰气味有毒

急性毒性。危险特性：具有较强的腐蚀性。能与一些活性金属粉末发生反应。若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。

燃烧（分解）产物：溴化氢。

溴化氢，别名氢溴酸，溴化氢是化学式为HBr的二元化合物，分子量80.91，标准情况下为气体。具有较强的腐蚀性。能与一些活性金属粉末发生反应。若遇高热，容器内压增大，有开裂和爆炸的危险。人吸入的小中毒浓度为5ppm。溴化氢可引起皮肤、粘膜的刺激或灼伤。长期低浓度接触可引起呼吸道刺激症状和消化功能障碍。

2010年版药典三部附录Ⅷ简介

按国标《小麦粉国家质量标准》GB1355规定，面粉检测项目及标准要求：

1、中筋小麦粉检测的项目及标准

2、强筋、弱筋小麦粉检测的项目及标准

参考资料：

《小麦粉国家质量标准》GB135是国家强制性标准。

1、该标准是对GB 1355-1986《小麦粉》、GB/T 8607-1988《高筋小麦粉》、GB/T 8608-1988《低筋小麦粉》、《专用小麦粉》LS/T3201～3208-1993的修订与合并。

2、该标准的结构、编写规则及规范性技术要素按GB/T 1.1-2000《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》及GB/T 1.2-2002《标准化工作导则第2部分：标准中规范性技术要素内容的确定方法》进行修改。

参考资料来源：百度百科-小麦粉国家质量标准

二乙烟酰胺简介

目录1 拼音2 附录Ⅷ A 免疫印迹法 2.1 试剂2.2 检查法2.3 结果判定 3 附录Ⅷ B 免疫斑点法 3.1 试剂3.2 检查法3.3 结果判定 4 附录Ⅷ C 免疫双扩散法 4.1 供试品溶液的制备4.2 试剂4.3 检查法4.4 结果判定 5 附录Ⅷ D 免疫电泳法 5.1 试剂5.2 对照品5.3 供试品溶液的制备5.4 检查法5.5 注意事项 6 附录Ⅷ E 肽图检查法 6.1 第一法  胰蛋白酶裂解－反相高效液相色谱法 6.1.1 色谱条件6.1.2 检查法 6.2 第二法  溴化氰裂解法 7 附录Ⅷ G A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法 7.1 第一法  测磷法（仲裁法） 7.1.1 试剂7.1.2 色谱柱的制备7.1.3 色谱柱的标定7.1.4 测定法 7.2 第二法  仪器法 7.2.1 色谱柱的标定7.2.2 测定法 7.3 【附注】 8 附录Ⅷ H 伤寒Vi多糖分子大小测定法 8.1 试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定8.2 测定法8.3 【附注】 9 附录Ⅷ I 牛血清白蛋白残留量测定法 9.1 供试品溶液的制备9.2 干扰试验9.3 测定法9.4 【附注】 10 附录Ⅷ J b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 10.1 试剂10.2 测定法10.3 结果计算 11 附录Ⅷ K 己二酰肼含量测定法 11.1 试剂11.2 测定法 12 附录Ⅷ L 高分子结合物含量测定法 12.1 试剂12.2 供试品溶液的制备12.3 测定法12.4 结果计算 13 参考资料 1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅷ

《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录Ⅷ

2 附录Ⅷ A 免疫印迹法

本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。

2.1 试剂

（1）TG缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。

（2）EBM缓冲液  量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。

（3）TTBS缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷6.05g与氯化钠4.5g，量取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。

（4）底物缓冲液  称取3,3'二氨基联苯胺盐酸盐15mg，加甲醇5ml与30%过氧化氢15μl，加TTBS缓冲液25ml使溶解，即得。临用现配。

2.2 检查法

照SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（2010年版药典三部附录Ⅳ C），供试品与阳性对照品上样量应大于100ng。取出凝胶，切去凝胶边缘，浸于EBM缓冲液中30分钟。另取与凝胶同样大小的厚滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，用EBM缓冲液浸透。用半干胶转移仪进行转移：在电极板上依次放上湿滤纸3张、硝酸纤维素膜1张、电泳凝胶、湿滤纸3张，盖上电极板，按0.8mA/cm2硝酸纤维素膜恒电流转移45分钟。

取出硝酸纤维素膜浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，再加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8汾钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动，加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液，置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。

2.3 结果判定

阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。

3 附录Ⅷ B 免疫斑点法

本法系以供试品与特异性抗体结合后，抗体再与酶标抗体特异性结合，通过酶学反应的显色，对供试品的抗原特异性进行检查。

3.1 试剂

（1） TG缓冲液  精密称取三羟甲基氨基甲烷15.12g与甘氨酸72g，加水溶解并稀释至500ml。4℃保存。

（2） EBM缓冲掖  量取TG缓冲液20ml、甲醇40ml，加水稀释至200ml。4℃保存。

（3） TTBS缓冲液  称取三羟甲基氨基甲烷6.05g、氯化钠4.5g，吸取聚山梨酯80 0.55ml，加适量水溶解，用盐酸调pH值至7.5，加水稀释至500ml。4℃保存。

（4）底物缓冲液  称取3,3'二氨基联苯胺盐酸盐（DAB）15mg，取甲醇5ml、30%过氧化氢15μl，溶于25ml TTBS缓冲液中。用前配制。

3.2 检查法

取硝酸纤维素膜，用EBM缓冲液浸泡15分钟，将供试品、阴性对照品（可用等量的人白蛋白）及阳性对照品点在膜上，上样量应大于10ng。室温干燥60分钟。取出硝酸纤维素膜，浸入封闭液（10%新生牛血清的TTBS缓冲液，或其他适宜的封闭液）封闭60分钟。弃去液体，加入TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的供试品抗体（参考抗体使用说明书的稀释度稀释），室温过夜。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的生物素标记的第二抗体，室温放置40分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗3次，每次8分钟。弃去液体，更换TTBS缓冲液10ml，摇动加入适量的亲和素溶液和生物素标记的辣根过氧化物酶溶液，室温放置60分钟。硝酸纤维素膜用TTBS缓冲液淋洗1次，再用TTBS缓冲液浸洗4次，每次8分钟。弃去液体，加入适量底物缓冲液置于室温避光条件下显色，显色程度适当时水洗终止反应。

3.3 结果判定

阳性结果应呈现明显色带。阴性结果不显色。

4 附录Ⅷ C 免疫双扩散法

本法系在琼脂糖凝胶板上按一定距离打数个小孔，在相邻的两孔内分别加入抗原与抗体，若抗原、抗体互相对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原与抗体孔之间形成免疫复合物的沉淀线，以此对供试品的特异性进行检查。

4.1 供试品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将供试品的蛋白质浓度稀释至适当浓度。

4.2 试剂

（1）0.5%氨基黑染色剂  称取氨基黑10B0.5g，加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解，即得。

（2）脱色液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml混合均匀，即得。

4.3 检查法

将完全溶胀的1.5%琼脂糖溶液倾倒于水平玻板上（每平方厘米加0.19ml琼脂糖），凝固后，按下图打孔，直径3mm，孔距3mm（方阵型）。根据需要确定方阵型图数量。中央孔加入抗血清，周边孔加入供试品溶液，并留1孔加入相应阳性对照血清。每孔加样20μl，然后置水平湿盒中，37℃水平扩散24小时。用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液中染色。用脱色液脱色至背景无色，沉淀线呈清晰蓝色为止。用适当方法保存或复制图谱。

图 方阵型

4.4 结果判定

各阳性对照出现相应的沉淀线则试验成立，供试品与人血清（血浆）抗体之间应出现相应沉淀线，表示两者具有同源性。

5 附录Ⅷ D 免疫电泳法

本法系将供试品通过电泳分离成区带的各抗原，然后与相应的抗体进行双相免疫扩散，当两者比例合适时形成可见的沉淀弧。将沉淀弧与已知标准抗原、抗体生成的沉淀弧的位置和形状进行比较，即可分析供试品中的成分及其性质。

5.1 试剂

（1）巴比妥缓冲液（pH8.6）  称取巴比妥4.14g与巴比妥钠23.18g，加适量水，加热使溶解，冷却至室温，再加叠氮钠0.15g，加水使溶解成1500ml。

（2）0.5%氨基黑染液  称取氨基黑10B 0.5g．加甲醇50ml、冰醋酸10ml与水40ml的混合液，溶解。

（3）1.5%琼脂糖溶液  称取琼脂糖1.5g，加水50ml与巴比妥缓冲液50ml，加热使溶胀完全。

（4）脱色液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml与水50ml，混合均匀。

（5）溴酚蓝指示液  称取溴酚蓝50mg，加水使溶解成100ml。

5.2 对照品

正常人血清或其他适宜的对照品。

5.3 供试品溶液的制备

用生理氯化钠溶液将供试品蛋白质浓度稀释成0.5%。

5.4 检查法

将1.5%琼脂糖溶液倾倒于大小适宜的水平玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶凝固成无气泡的均匀薄层后，于琼脂糖凝胶板负极1/3处的上下各打1孔，孔径3mm，孔距10～15mm。测定孔加供试品溶液10μl和溴酚蓝指示液1滴，对照孔加正常人血清或人血浆10μl和溴酚蓝指示液1滴。用3层滤纸搭桥和巴比妥缓冲液（电泳缓冲液）接触，100V恒压电泳约2小时（指示剂迁移到前沿）。电泳结束后，在两孔之间距离两端约3～5mm处挖宽3mm槽，向槽中加入血清抗体或人血浆抗体，槽满但不溢出。放湿盒中37℃扩散24小时。扩散完毕后，用生理氯化钠溶液充分浸泡琼脂糖凝胶板，以除去未结合蛋白质。将浸泡好的琼脂糖凝胶板放入0.5%氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背景基本无色。用适当方法保存或复制图谱。与对照品比较，供试品的主要沉淀线应为待测蛋白质。

5.5 注意事项

（1）电泳时应有冷却系统，否则琼脂糖凝胶会出现干裂。

（2）用生理氯化钠溶液浸泡应充分，否则背景不清晰。

6 附录Ⅷ E 肽图检查法

本法系通过蛋白酶或化学物质裂解蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一级结构的完整性和准确性。

6.1 第一法  胰蛋白酶裂解－反相高效液相色谱法

照高效液相色谱法（2010年版药典三部附录Ⅲ B）测定。

6.1.1 色谱条件

以蛋白质与多肽分析用辛烷基硅烷键合硅胶或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；柱温为30℃±5℃，对照品与供试品保存温度为2～8℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液为流动相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B液，流速为每分钟1ml，梯度洗脱70分钟（A液从100%～30%，B液从0～70%），检测波长为214nm。

6.1.2 检查法

取供试品溶液及对照品溶液（均为每1ml中含1mg的溶液，如供试品和对照品浓度不够，则应浓缩至相应的浓度），分别用1%碳酸氢铵溶液充分透析，按1：50 （mg/mg）加入胰蛋白酶溶液[取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮处理过的（或序列分析纯）胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每1ml中含0.1mg的溶液]到供试品溶液与对照品溶液中，于37℃保温16～24小时后，按1: 10加入50%醋酸溶液，以每分钟10000转离心5分钟（或用0.45μm滤膜滤过），精密量取上清液100μl，分别注入液相色谱仪，梯度洗脱，记录色谱图。将供试品溶液的图谱与对照品溶液的图谱进行比较，即得。

6.2 第二法  溴化氰裂解法

检查法  取供试品与对照品适量（约相当于蛋白质50μg），用水透析16小时，冷冻干燥，加溴化氰裂解液（称取溴化氰0.3g，加甲酸（70→100）1ml使溶解]20μl溶解，室温放置24小时，裂解物加水180μl，再冷冻干燥。冻干的裂解物用水复溶至适当浓度．照SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（附录Ⅳ C）（胶浓度20%）进行电泳，用银染法染色。

将供试品图谱与对照品图谱进行比较，即得。

7 附录Ⅷ G A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法7.1 第一法  测磷法（仲裁法）

本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）和多糖在规定KD值以前的回收率。

7.1.1 试剂

（1）流动相  称取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g，加水使溶解成1000ml，混匀，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH值至7.0。

（2）蓝色葡聚糖2000溶液  称取蓝色葡聚糖200020mg，加流动相使溶解成10ml。

（3）维生素B12溶液  称取10mg维生素B12，加流动相使溶解成10ml。

7.1.2 色谱柱的制备

取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL4B凝胶约200ml，加流动相400ml充分搅拌，放置约1小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3～5次后，加流动相200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于1.5cm×90cm色谱柱中，约87cm高，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，以2～3倍柱床体积的流动相洗脱（约500ml），使柱床平衡。

7.1.3 色谱柱的标定

取蓝色葡聚糖2000溶液1ml，加至已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集3～5ml，照紫外－可见分光光度法（附录Ⅱ A），在波长260nm处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光度为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标分别作图，波长260nm处的峰顶洗脱液体积为空流体积VO。

量取维生素B12溶液1ml，自“加至已平衡的色谱柱中”起，同法操作，370nm波长处的峰顶洗脱液体积为柱床体积Vi。

7.1.4 测定法

取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg．如为冻干制品可用流动相溶解），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集5ml，照磷测定法（2010年版药典三部附录Ⅶ A）测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷含量为纵坐标，洗脱液体积（ml）为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为Ve。

按下式计算：

式中  KD为供试品分配系数；

Ve为供试品洗脱液体积，ml

VO为空流体积，ml；

Vi为柱床体积，ml。

计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：

式中RX为KD值<0.5供试品的多糖回收率，%；

AX为供试品在KD值<0.5各管洗脱液的磷含量之和；

A为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。

7.2 第二法  仪器法

试剂与色谱柱的制备同第一法。

7.2.1 色谱柱的标定

量取蓝色葡聚糖2000溶液1ml与维生素B12溶液0.2ml；混匀后加至已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为篮色葡聚糖2000峰，峰顶的洗脱液体积为空流体积VO；第二峰为维生素B12峰，峰顶的洗脱液体积为柱床体积Vi。

7.2.2 测定法

取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，检测波长206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。按下式计算：

式中  KD为供试品分配系数；

Ve为供试品洗脱液体积，ml；

VO为空流体积，ml

Vi为柱床体积，ml。

计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率：

式中RX为KD值<0.5供试品的多糖回收率，%；

AX为供试品在KD值<0.5的色谱图面积；

At为供试品色谱图总面积。

7.3 【附注】

过柱操作在10～20℃进行。

8 附录Ⅷ H 伤寒Vi多糖分子大小测定法

本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数（KD）和多糖在规定KD值以前的回收率。

8.1 试剂、色谱柱的制备与色谱柱标定

同附录Ⅷ G 第二法。

8.2 测定法

取供试品约1ml（含多糖抗原3～5mg），加至已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管3～5ml。照O乙酰基测定法（2010年版药典三部附录Ⅵ F），测定每管洗脱液中O乙酰基的含量，求出O乙酰基含量最高时的洗脱体积，即为多糖主峰峰顶洗脱体积Ve。

按下式计算：

式中KD为供试品分配系数；

Ve为供试品洗脱液体积，ml；

VO为空流体积，ml；

Vi为柱床体积，ml。

计算供试品在KD值≤0.25的多糖回收率：

式中RX为KD值≤0.25供试品的多糖回收率，%；

AX为供试品在KD值≤0.25各管洗脱液等体积合并液的O乙酰基含量；

At为供试品所有管洗脱液等体积合并液的O乙酰基含量。

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8.3 【附注】

过柱操作在10～20℃进行。

9 附录Ⅷ I 牛血清白蛋白残留量测定法

本法系采用酶联免疫法测定供试品中残余牛血清白蛋白含量。

9.1 供试品溶液的制备

供试品如为冻干剂型，检测前应按标示量复溶后混匀，室温静置30分钟，检测前应再次混匀。供试品如为液体剂型可直接用于检测。

9.2 干扰试验

首次采用该法检测的供试品应进行干扰试验。

制备溶液Ⅰ（供试品倍比稀释）、溶液Ⅱ（供试品和30ng/ml的内控标准品等量混合）和溶液Ⅲ（30ng/ml的内控标准品倍比稀释）。当供试品溶液BSA含量高于试剂盒测定范围中点时，则2倍稀释后制备溶液Ⅰ和溶液Ⅱ。溶液Ⅰ、溶液Ⅱ可倍比稀释测定，溶液Ⅲ应多孔测定（至少10孔以上），并在试验间均匀添加。按测定法操作，分别测定溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ的BSA含量，溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的含量之差应在溶液Ⅲ含量测定值的95%可信区间内，表明供试品不会对该检测法产生干扰作用。

9.3 测定法

按试剂盒说明书进行，并采用试剂盒提供的供试品稀释液稀释供试品，供试品应至少进行2个稀释度测定，每个稀释度做双孔平行测定。试剂盒标准品的吸光度、内控参考品测定值、标准品线性相关系数、双孔测定吸光度均应在试剂盒要求范围内，试验有效。以标准品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光度代入直线回归方程，再乘以稀释倍数，计算出供试品中BSA含量。

9.4 【附注】

（1）当同一供试品的低稀释度吸光度明显低于高稀释度吸光度时，可能存在HOOK效应或操作失误，需重试或调整稀释倍数进行检测。

（2）测定BSA含量的容器具应专用，防止实验室中BSA污染。

10 附录Ⅷ J b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法

本法系依据可溶性糖经无机酸处理脱水产生糖醛（戊糖）或糖醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质，以此测定多糖的含量。

10.1 试剂

（1）0.1%三氯化铁盐酸溶液  准确称取三氯化铁（FeCl3·6H2O）0.1g，放入清洁的试剂瓶内，加盐酸100ml，待溶解后置2～8℃冰箱保存。

（2）地衣酚（3,5二羟基甲苯）[1]乙醇溶液  称取地衣酚1g，放入10ml量瓶中，加95%乙醇至10ml。临用前配制。

（3） 25μg/ml核糖对照品溶液  称取D核糖1.25mg，置50ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。

10.2 测定法

量取1ml水，加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液，混匀后再加入0.4ml地衣酚乙醇溶液，混匀。水浴5分钟后置冰浴，在波长670nm处测定吸光度，作为空白对照。

先将供试品用水稀释至核糖含量不高于25μg/ml，作为供试品溶液，量取1.0ml自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。

分别取核糖对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于10ml试管中，每管依次加水0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。

10.3 结果计算

以核糖对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出供试品溶液的核糖含量。

供试品多糖含量（μg/ml）a×n/0.41

式中a为供试品溶液的核糖含量，μg/ml

n为供试品稀释倍数。

11 附录Ⅷ K 己二酰肼含量测定法

本法系依据在四硼酸钠存在的条件下，己二酰肼（ADH）中的氨基基团能与三硝基苯磺酸（TNBS）发生显色反应，采用紫外－可见分光光度法测定b型流感嗜血杆菌多糖衍生物中己二酰肼的含量。

11.1 试剂

（1）己二酰肼对照品贮备液（1mg/ml）  精密称定己二酰肼0.100g，加水定容至100ml，于20℃保存。

（2）己二酰肼对照品工作液（20μg/ml）  精密量取ADH对照品贮备液0.2ml，加水定容至10ml。

（3）5%四硼酸钠溶液  称取四硼酸钠（Na2B4O7·10H2O） 47.35g[1]，加水定容至500ml，于室温保存。

（4） 3% TNBS溶液  量取TNBS 5ml，加水定容至50ml，于20℃保存。

11.2 测定法

量取5%四硼酸钠溶液1.0ml，加水1ml，混匀，再加入3% TNBS溶液0.3ml，混匀，于室温放置15分钟，在波长500nm处测定吸光度，作为空白对照。先将供试品用水稀释至己二酰肼浓度不高于20μg/ml，作为供试品溶液，然后取1.0ml，加入5%四硼酸钠溶液1.0ml，自“加入3% TNBS溶液0.3ml”起同法操作。

分别取己二酰肼对照品工作液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，加入5%四硼酸钠溶液1.0ml，自“加入3% TNBS溶液0.3ml”起同法操作。结果计算  以己二酰肼对照品工作液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程，将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出供试品溶液的己二酰肼含量，根据稀释倍数计算供试品的己二酰肼含量。

12 附录Ⅷ L 高分子结合物含量测定法

本法系利用高分子结合物、低分子结合物及游离多糖在不同乙醇浓度下，沉淀分离，采用紫外－可见分光光度法测定磷含量，计算高分子结合物的含量。

12.1 试剂

（1） 5mol/L氯化钠溶液  精密称定氯化钠29.22g，加水溶解并稀释至100ml，室温保存。

（2） 1.5mol/L硫酸  于1体积98%的硫酸中加入11体积的水，混匀。

（3） 2.5%钼酸铵  称取钼酸铵2.65g[1]，加水溶解并稀释至100ml。

（4）10%抗坏血酸  称取抗坏血酸10g，加水溶解并稀释至100ml。

（5）矿化试剂  硫酸与70%高氯酸等体积混合制得。

（6）产色试剂  水、1.5mol/L硫酸、2.5%钼酸铵、10%抗坏血酸，按2:1:1:1体积比混合配制。

（7）80μg/ml磷对照品贮备液  精密称定经100℃干燥的磷酸氢二钠0.3665g或磷酸二氢钾0.3509g[1]，加水500ml、5mol/L硫酸溶液10ml溶解，补加水至1000ml。临用时，将贮备液做20倍稀释，即为4μg/ml磷对照品工作液。

（8）1.0mol/L氢氧化钠溶液  称取4g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。

12.2 供试品溶液的制备

（1）分步沉淀  原液用生理氯化钠溶液稀释至多糖含量20～28μg/ml或成品疫苗3ml，加入5mol/L氯化钠溶液0.75ml，混匀后加入无水乙醇15ml，于20℃冰箱放置72～96小时，以每分钟8000转4℃离心90分钟，吸取上清液为供试品溶液2；于沉淀中加入50%乙醇溶液0.5ml，加玻璃珠，混合后室温放置1小时；再加入50%乙醇溶液1.5ml，混合后室温放置2小时，然后以每分钟8000转8℃离心l小时，吸取1.8ml上清液为供试品溶液3；沉淀再加入1.0mol/L氢氧化钠溶液0.5ml，混合后室温放置1小时，加水1.25ml，作为供试品溶液4。

（2）取多糖含量20～28μg/ml的原液或成品疫苗1.0ml为供试品1。

（3）供试品溶液的矿化  分别量取1.0ml供试品1、1.5ml供试品溶液2、0.7ml供试品溶液3、0.5ml供试品溶液4各2份；分别加入矿化试剂0.15ml，置150℃干燥1小时，然后升温至180℃干燥30分钟，再升温至250℃干燥1小时。

12.3 测定法

量取水1.95ml，加矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度，作为空白对照。

于矿化好的供试品溶液中加水1.85ml，加产色试剂2.0ml，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测定吸光度。

分别量取磷对照品工作液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.8ml、1.0ml于试管中，每管依次加水1.85ml、1.75ml、1.55ml、1.15ml、0.95ml；然后每管分别加入矿化试剂50μl后加2.0ml产色试剂，混匀后置37℃水浴2小时，在波长825nm处测吸光度。

12.4 结果计算

以磷对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代入直线回归方程，求出磷含量。

供试品磷含量（μg/ml）分别为：

P1 （A1×3）/1.0

P2（A2×18. 75）/1.5

P3 （A3×2.0）/0.7

P4 （A4×2.0）/0.5（P3×10）/100

试验有效性  80%≤P1/（P2+P3+P4）≤120%

供试品高分子结合物含量（%）P4/（P2+P3+P4）×100

供试品游离多糖含量（%）[1P4/（P2+P3+P4）]×100

生物化学王镜岩第三版第四章第三题标准答案

目录1 概述2 尼可刹米药典标准 2.1 品名 2.1.1 中文名2.1.2 汉语拼音2.1.3 英文名 2.2 结构式2.3 分子式与分子量2.4 来源（名称）、含量（效价）2.5 性状 2.5.1 相对密度2.5.2 凝点2.5.3 折光率 2.6 鉴别2.7 检查 2.7.1 酸堿度2.7.2 溶液的澄清度与颜色2.7.3 氯化物2.7.4 有关物质2.7.5 易氧化物2.7.6 水分 2.8 含量测定2.9 类别2.10 贮藏2.11 制剂2.12 版本 3 尼可刹米说明书 3.1 药品名称3.2 英文名称3.3 二乙烟酰胺的别名3.4 分类3.5 剂型3.6 尼可刹米的药理作用3.7 尼可刹米的药代动力学3.8 尼可刹米的适应证3.9 尼可刹米的禁忌证3.10 注意事项3.11 尼可刹米的不良反应3.12 尼可刹米的用法用量3.13 二乙烟酰胺与其它药物的相互作用3.14 专家点评 4 尼可刹米中毒 4.1 临床表现4.2 诊断4.3 治疗 5 参考资料这是一个重定向条目，共享了尼可刹米的内容。为方便阅读，下文中的 尼可刹米 已经自动替换为 二乙烟酰胺 ，可 点此恢复原貌 ，或 使用备注方式展现 1 概述

二乙烟酰胺是一种中枢兴奋药，为无色至淡黄色的澄清油状液体；放置冷处，即成结晶；有轻微的特臭，味苦；有引湿性。能直接兴奋延髓呼吸中枢，使呼吸加深加快。也有通过颈动脉化学感受器反射的间接兴奋作用，从而使呼吸加深加快，对伴有高碳酸血症的呼吸衰竭，能拮抗二氧化碳对中枢的麻醉作用。对血管运动中枢有轻微的兴奋作用。临床用于中枢性呼吸及循环衰竭、 *** 、其他中枢抑制药的中毒急救。

2 二乙烟酰胺药典标准2.1 品名2.1.1 中文名

二乙烟酰胺

2.1.2 汉语拼音

Nikeshami

2.1.3 英文名

Nikethamide

2.2 结构式

2.3 分子式与分子量

C10H14N2O    178.23

2.4 来源（名称）、含量（效价）

本品为N,N二乙基烟酰胺。含C10H14N2O不得少于98.5% （g/g）。

2.5 性状

本品为无色至淡黄色的澄清油状液体；放置冷处，即成结晶；有轻微的特臭，味苦；有引湿性。

本品能与水、乙醇、三氯甲烷或乙醚任意混合。

2.5.1 相对密度

本品的相对密度（2010年版药典二部附录Ⅵ A）在25℃时为1.058～1.066。

2.5.2 凝点

本品的凝点（2010年版药典二部附录Ⅵ D）为22～24℃。

2.5.3 折光率

本品的折光率（2010年版药典二部附录Ⅵ F）在25℃时为1.522～1.524。

2.6 鉴别

（1）取本品10滴，加氢氧化钠试液3ml，加热，即发生二乙胺的臭气，能使湿润的红色石蕊试纸变蓝色。

（2）取本品1滴，加水50ml，摇匀，分取2ml，加溴化氰试液2ml与2.5%苯胺溶液3ml，摇匀，溶液渐显黄色。

（3）取本品2滴，加水1ml，摇匀，加硫酸铜试液2滴与硫氰酸铵试液3滴，即生成草绿色沉淀。

（4）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（《药品红外光谱集》135图）一致。

2.7 检查2.7.1 酸堿度

取本品5.0g，加水溶解并稀释至20ml，依法测定（2010年版药典二部附录Ⅵ H），pH值应为6.5～7.8。

2.7.2 溶液的澄清度与颜色

取本品2.5g，加水溶解并稀释至10ml，溶液应澄清无色；如显浑浊，与1号浊度标准液（2010年版药典二部附录Ⅸ B）比较，不得更浓；如显色，与黄色1号标准比色液（2010年版药典二部附录Ⅸ A第一法）比较，不得更深。

2.7.3 氯化物

取本品5.0g，依法检查（2010年版药典二部附录Ⅷ A），与标准氯化钠溶液7.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.0014%）。

2.7.4 有关物质

取本品适量，用水稀释制成每1ml中约含4mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照高效液相色谱法（2010年版药典二部附录Ⅴ D）试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇－水（30：70）为流动相，检测波长为263nm。理论板数按二乙烟酰胺峰计算不低于2000，二乙烟酰胺峰与其相邻杂质峰的分离度应符合要求。取对照溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%。精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2倍。供试品溶液色谱图中如有杂质峰，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的0.5倍（0.5%）。

2.7.5 易氧化物

取本品1.2g，加水5ml与高锰酸钾滴定液（0.02mol/L）0.05ml，摇匀，粉红色在2分钟内不得消失。

2.7.6 水分

取本品0.5g，加二硫化碳5ml，立即摇匀观察，溶液应澄清。

2.8 含量测定

取本品约0.15g，精密称定，加冰醋酸10ml与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝绿色，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml高氯酸滴定液（0.1mol/L）相当于17.82 mg的C10H14N2O。

2.9 类别

中枢兴奋药。

2.10 贮藏

遮光，密封保存。

2.11 制剂

二乙烟酰胺注射液

2.12 版本

《中华人民共和国药典》2010年版

3 二乙烟酰胺说明书3.1 药品名称

二乙烟酰胺

3.2 英文名称

Nikethamide

3.3 二乙烟酰胺的别名

尼可刹米；可拉明；盐酸乙胺 ,烟酸二乙胺；烟酸乙胺；Coramine；Niketamid；Nikethylamidum

3.4 分类

神经系统药物 >中枢兴奋药物 >延髓兴奋药

3.5 剂型

针剂：每支0.25g（1ml），0.375g（1.5ml），0.5g（2ml）。

3.6 二乙烟酰胺的药理作用

二乙烟酰胺能直接兴奋延髓呼吸中枢，使呼吸加深加快。也可通过 *** 颈动脉窦和主动脉体的化学感受器，反射性地兴奋呼吸中枢，并提高呼吸中枢对二氧化化碳的敏感性。对大脑皮质、血管运动中枢及脊髓也有较弱的兴奋作用，对其他器官则无直接兴奋作用，剂量过大可引起惊厥。二乙烟酰胺具有作用温和、安全范围大、毒性较小的特点。

3.7 二乙烟酰胺的药代动力学

口服及注射易吸收，作用时间短暂，一次静脉注射只能维持作用5～10min，这可能是因为药物进入机体后迅速分布全身各部位的结果。药物在体内代谢为烟酰胺，然后再被甲基化为N甲基烟酰胺，经尿排出。

3.8 二乙烟酰胺的适应证

用于中枢性呼吸及循环衰竭、 *** 、其他中枢抑制药的中毒急救。

用于呼吸抑制抢救，二乙烟酰胺为最常用的呼吸兴奋剂，可用于各种原因引起的中枢性呼吸抑制，其中对吗啡类药物中毒所致呼吸抑制效果最好，对吸入全麻药中毒次之，对巴比妥药物中毒效果最差。对肺心病引起的呼吸衰竭有效。各种原因引起的慢性阻塞性肺疾患并伴有高碳酸血症等。

3.9 二乙烟酰胺的禁忌证

1.孕妇、哺乳者、对二乙烟酰胺过敏者、儿童以及急性卟啉症禁用。

2.小儿高热和无呼吸衰竭时禁用。

3.禁与巴比妥类、洋地黄类在同一溶液中给药，禁止与水解蛋白配伍。

3.10 注意事项

1.脑水肿、心动过速、甲亢、心律不齐、心脏病、嗜酪细胞瘤、支气管哮喘、溃疡病、急性心绞痛及孕妇、急性血卟啉症。

2.对呼吸肌麻痹者无效。

3.出现血压升高、震颤时应及时停药。

4.二乙烟酰胺不可动脉注射，因可致动脉痉挛和血栓。一旦出现面部肌肉痉挛，肢体抽动等惊厥征兆应立即停药或减量。

5.过量可引起癫痫样惊厥，随之出现昏迷。惊厥发作可静脉注射苯二氮卓类药或小剂量硫喷妥钠控制。

6.与鞣酸、有机堿盐类及各种金属盐类配伍，均可能产生沉淀；遇堿类加热可水解，并脱去乙二胺基生成烟酸盐。

7.用药时须配合人工呼吸和给氧措施。

3.11 二乙烟酰胺的不良反应

可引起多汗、恶心、呕吐、打喷嚏、呛咳、面部潮红、全身瘙痒、皮疹等，大剂量时可引起心悸、血压升高、脉搏加快、心律失常、震颤及肌肉僵直。严重者可致惊厥，应及时停药。惊厥时可立刻注射苯二氮卓类或小剂量硫喷妥钠控制。

3.12 二乙烟酰胺的用法用量

1.皮下注射、静注或肌注，每次0.25～0.5g，必要时1～2h重复1次，极量每次1.25g；6个月～1岁小儿每次75mg。

2.口服：成人每次0.25～0.5g，每天2次。

3.13 药物相互作用

1.苯巴比妥钠、戊巴比妥钠、异戊巴比妥钠、司可巴比妥钠、硫喷妥钠、苯妥英钠、氯氮、甲丙氨酯。盐酸酚芐明、双嘧达莫（潘生丁）、溴芐铵、硝普钠、二氮嗪、氨茶堿、氢氯噻嗪、呋塞米（速尿）、利尿酸钠、促皮质素、水银蛋白、复方氨基酸、碳酸氢钠、盐酸异丙嗪、盐酸维洛沙秦、盐酸阿糖胞苷、硫酸长春新堿，所有油溶性针剂，所有菌、疫苗。

2.二乙烟酰胺注射剂与氯霉素注射剂配伍，在混合前应用注射用水稀释。二乙烟酰胺过量引起的昏迷，用呼吸兴奋药和其他中枢兴奋药无效；与堿性药物配伍，可致动脉栓塞。

3.14 专家点评

二乙烟酰胺相对安全范围大，在体内维持时间短，用药后则以小量、间歇、交替给药为好。与洛贝林或咖啡因交替使用，可增强疗效。对吗啡引起的呼吸抑制效果较好；对巴比妥类引起的呼吸抑制疗效较差；对呼吸肌麻痹引起的呼吸抑制无效。一旦出现面部肌肉痉挛、肢体抽动等惊厥征兆应立即停药或减量。使用二乙烟酰胺同时，应积极处理原发病、给氧、气道支持、控制感染等措施，这是抢救成功的根本和关键。

4 二乙烟酰胺中毒

二乙烟酰胺（可拉明、尼可刹米）对延髓呼吸中枢具有直接兴奋作用，也有通过颈动脉化学感受器反射的间接兴奋作用，从而使呼吸加深加快，对伴有高碳酸血症的呼吸衰竭，能拮抗二氧化碳对中枢的麻醉作用。对血管运动中枢有轻微的兴奋作用。[1]

4.1 临床表现

本品的有效治疗量与中毒量是较接近的，过量反应有不安、瘙痒、颜面潮红、出汗、咳嗽、恶心、呕吐及肌肉抽搐，特别是面部肌肉抽搐，此时应避免继续给药，以防止惊厥发生。本品可皮下、肌肉或静脉注射，极量是1.25g/次。[2]

4.2 诊断

二乙烟酰胺中毒的诊断要点为[2]：

有二乙烟酰胺应用史，出现上述表现。

4.3 治疗

二乙烟酰胺中毒的治疗要点为[2]：

1.如果一个相对分子质量为12000的蛋白质，含10种氨基酸，并假设每种氨基酸在该蛋白质分子中的数目相等，问这种蛋白质有多少种可能的排列顺序？[10100]解：1012000/120=10100 2、有一个A肽，经酸解分析得知为Lys、His、Asp、Glu2、Ala以及Val、Tyr和两个NH3分子组成。当A肽与FDNB试剂反应后得DNP-Asp；当用羧肽酶处理后得游离缬氨酸。如果我们在实验中将A肽用胰蛋白酶降解时，得到两种肽，其中一种（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）在pH6.4时，净电荷为零，另一种（His、Glu以及Val）可给除DNP-His，在pH6.4时，带正电荷。此外，A肽用糜蛋白酶降解时，也得到两种肽，其中一种（Asp、Ala、Tyr）在pH6.4时全中性，另一种（Lys、His、Glu2以及Val）在pH6.4时带正电荷。问A肽的氨基酸序列如何？[Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val]解：1、N-末端分析：FDNB法得：Asp-；2、C-末端分析：羧肽酶法得：-Val；3、胰蛋白酶只断裂赖氨酸或精氨酸残基的羧基形成的肽键，得到的是以Arg和Lys为C-末端残基的肽断。酸水解使Asn→Asp+ NH4+，由已知条件（Lys、Asp、Glu、Ala、Tyr）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-( )-( )-Val；4、FDNB法分析N-末端得DNP-His，酸水解使Gln→Glu+NH4+由已知条件（His、Glu、Val）可得：Asn-( )-( )-( )-Lys-His-Gln-Val；5、糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键。由题，得到的一条肽（Asp、Ala、Tyr）结合（3）、（4）可得该肽的氨基酸序列为：Asn-Ala-Tyr-Glu-Lys-His-Gln-Val 3、某多肽的氨基酸序列如下：Glu-Val-Lys-Asn-Cys-Phe-Arg-Trp-Asp-Leu-Gly-Ser-Leu-Glu-Ala-Thr-Cys-Arg-His-Met-Asp-Gln-Cys-Tyr-Pro-Gly-Glu_Glu-Lys。（1）如用胰蛋白酶处理，此多肽将产生几个肽？并解释原因（假设没有二硫键存在）；（2）在pH7.5时，此多肽的净电荷是多少单位？说明理由（假设pKa值：α-COOH4.0；α- NH3+6.0；Glu和Asp侧链基4.0；Lys和Arg侧链基11.0；His侧链基7.5；Cys侧链基9.0；Tyr侧链基11.0）；（3）如何判断此多肽是否含有二硫键？假如有二硫键存在，请设计实验确定5，17和23位上的Cys哪两个参与形成？[（1）4个肽；（2）-2.5单位；（3）如果多肽中无二硫键存在，经胰蛋白酶水解后应得4个肽段；如果存在一个二硫键应得3个肽段并且个肽段所带电荷不同，因此可用离子交换层析、电泳等方法将肽段分开，鉴定出含二硫键的肽段，测定其氨基酸顺序，便可确定二硫键的位置] 4、今有一个七肽，经分析它的氨基酸组成是：Lys、Pro、Arg、Phe、Ala、Tyr和Ser。此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸。经糜蛋白酶作用后，此肽断裂城两个肽段，其氨基酸组成分别为Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg。这两个肽段分别与FDNB反应，可分别产生DNP-Ser和DNP-Lys。此肽与胰蛋白酶反应能生成两个肽段，它们的氨基酸组成分别是Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala。试问此七肽的一级结构怎样？[它是一个环肽，序列为：-Phe-Ser-Ala-Tyr-Lys-Pro-Arg-]解：（1）此肽未经糜蛋白酶处理时，与FDNB反应不产生α-DNP-氨基酸，说明此肽不含游离末端NH2，即此肽为一环肽；（2）糜蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，由已知两肽段氨基酸组成（Ala、Tyr、Ser和Pro、Phe、Lys、Arg）可得：-( )-( )-Tyr-和-( )-( )-( )-Phe-；（3）由（2）得的两肽段分别与FDNB反应，分别产生DNP-Ser和DNP-Lys可知该两肽段的N-末端分别为-Ser-和-Lys-，结合（2）可得：-Ser-Ala-Tyr-和-Lys-( )-( )-Phe-；（4）胰蛋白酶专一断裂Arg或Lys残基的羧基参与形成的肽键，由题生成的两肽段氨基酸组成（Arg、Pro和Phe、Tyr、Lys、Ser、Ala）可得：-Pro-Arg-和-( )-( )-( )-( )-Lys；综合（2）、（3）、（4）可得此肽一级结构为：-Lys-Pro-Arg-Phe-Ser-Ala-Tyr- 5、三肽Lys- Lys- Lys的pI值必定大于它的任何一个个别基团的pKa值，这种说法是否正确？为什么？[正确，因为此三肽处于等电点时，七解离集团所处的状态是C-末端COO-（pKa=3.0），N末端NH2（pKa≌8.0），3个侧链3（1/3ε- NH3+）（pKa=10.53）,因此pI>最大的pKa值（10.53）] 6、一个多肽可还原为两个肽段，它们的序列如下：链1为Ala-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg- Arg-Val-Cys；链2为Cys-Tyr-Cys-Phe-Cys。当用嗜热菌蛋白酶消化原多肽（具有完整的二硫键）时可用下列各肽：（1）（Ala、Cys2、Val）；（2）（Arg、Lys、Phe、Pro）；（3）(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)；（4）(Cys2、Phe)。试指出在该天然多肽中二硫键的位置。（结构如下图）S-SAla-Cys-Phe-Pro-Lys-Arg-Trp-Cys-Arg-Arg-Val_CysSS Cys-Tyr-Cys-Phe-CysS-S解：嗜热菌蛋白酶作用专一性较差，根据题中已知条件：（1）消化原多肽得到（Ala、Cys2、Val），说明链1在2位Cys 后及11位Val前发生断裂，2位Cys与12位Cys之间有二硫键；（2）由链1序列可得该肽段序列为：-Phe-Pro-Lys-Arg-；（3）由（1）（2）可知该肽段(Arg2、Cys2、Trp、Tyr)中必有一Cys来自链2，另一Cys为链1中8位Cys，即链1中8位Cys与链2中的一个Cys有二硫键；（4）嗜热菌蛋白酶能水解Tyr、Phe等疏水氨基酸残基，故此肽（Cys2、Phe）来自链2，结合（3）中含Tyr，可知（3）中形成的二硫键为链1 8位Cys与链2中3位Cys与链2中3位Cys之间；（4）中（Cys2、Phe）说明链2中1位Cys与5位Cys中有二硫键。综合（1）、（2）、（3）、（4）可得结果。 7、一个十肽的氨基酸分析表明其水解液中存在下列产物：NH4+Asp Glu Tyr ArgMetPro Lys SerPhe并观察下列事实：（1）用羧肽酶A和B处理该十肽无效；（2）胰蛋白酶处理产生两个四肽和游离的Lys；（3）梭菌蛋白酶处理产生一个四肽和一个六肽；（4）溴化氢处理产生一个八肽和一个二肽，用单字母符号表示其序列为NP；（5）胰凝乳蛋白酶处理产生两个三肽和一个四肽，N-末端的胰凝乳蛋白酶水解肽段在中性pH时携带-1净电荷，在pH12时携带-3净电荷；（6）一轮Edman降解给出下面的PTH衍生物：写出该十肽的氨基酸序列。[Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro]解：（1）用羧肽酶A和B处理十肽无效说明该十肽C-末端残基为-Pro； （2）胰蛋白酶专一断裂Lys或Arg残基的羧基参与形成的肽键，该十肽在胰蛋白酶处理后产生了两个四肽和有利的Lys，说明十肽中含Lys-…或-Arg-…-Lys-Lys-…或-Arg-Lys-…-Lys-…Arg-Lys-…四种可能的肽段，且水解位置在4与5、5与6或4与5、8与9、9与10之间； （3）梭菌蛋白酶专一裂解Arg残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生一个四肽和一个六肽，则可知该十肽第四位为-Arg-； （4）溴化氰只断裂由Met残基的羧基参加形成的肽键，处理该十肽后产生一个八肽和一个二肽，说明该十肽第八位或第二位为-Met-；用单字母表示二肽为NP，即-Asn-Pro-，故该十肽第八位为-Met-； （5）胰凝乳蛋白酶断裂Phe、Trp和Tyr等疏水氨基酸残基的羧基端肽键，处理该十肽后，产生两个三肽和一个四肽，说明该十肽第三位、第六位或第七位为Trp或Phe； （6）一轮Edman降解分析N-末端，根据其反应规律，可得N-末端氨基酸残疾结构式为：-NH-CH(-CH2OH)-C(=O)-，还原为-NH-CH(-CH2OH)-COOH-，可知此为Ser； 结合（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）可知该十肽的氨基酸序列为：Ser-Glu-Tyr-Arg-Lys-Lys-Phe-Met-Asn-Pro 8、一个四肽，经胰蛋白酶水解得两个片段，一个片段在280nm附近有强的光吸收，并且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性。另一片段用溴化氰处理释放出一个与茚三酮反应呈黄色的氨基酸。写出此四肽的氨基酸序列。[YRMP]解：胰蛋白酶酶专一水解Lys和Arg残基的羧基参与形成的肽键，故该四肽中含Lys或Arg；一肽段在280nm附近有强光吸收且Pauly反应和坂口反应（检测胍基的）呈阳性，说明该肽段含Tyr和Arg；溴化氰专一断裂Met残基的羧基参加形成的肽键，又因生成了与茚三酮反应呈黄色的氨基酸，故该肽段为-Met-Pro-；所以该四肽的氨基酸组成为Tyr-Arg-Met-Pro，即YRMP。 9、蜂毒明肽（apamin）是存在蜜蜂毒液中的一个十八肽，其序列为CNCKAPETALCARRCQQH，已知蜂毒明肽形成二硫键，不与碘乙酸发生反应，（1）问此肽中存在多少个二硫键？（2）请设计确定这些（个）二硫键位置的策略。[（1）两个；（2）二硫键的位置可能是1-3和11-15或1-11和3-15或1-15和3-11，第一种情况，用胰蛋白酶断裂将产生两个肽加Arg；第二种情况和第三种，将产生一个肽加Arg，通过二硫键部分氧化可以把后两种情况区别开来。] 10、叙述用Mernfield固相化学方法合成二肽Lys-Ala。如果你打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能会掉进什么样的“陷坑”？解：（1）用BOC保护Ala氨基端，然后将其羧基挂接在树脂上；（2）除去N端保护，将用BOC保护的Arg用缩合剂DDC与Ala相连；（3）将把树脂悬浮在无水三氟乙酸中，通人干燥的HBr，使肽与树脂脱离，同时保护基也被切除。 若打算向Lys-Ala加入一个亮氨酸残基使成三肽，可能的坑为：Leu可能接在Arg的非α-氨基上。

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