提出判断一个基因是否适合作为抗菌靶标，其标准为什么

产后抑郁是一种高发而且对家庭和谐危害较大的疾病，关于产后抑郁的致病原因医学界尚未有最终定论。但说法纷纭，而且随着科技的发展和研究的深入，目前最新的观点是：产后抑郁症受基因影响。 这是英国研究人员的最新发现。研究人员先对老鼠做了一系列的试验，目的是追踪检验可能产生抑郁风险的基因。然后，他们又检测了35位孕妇的基因序列，最后确认有两种基因与产后抑郁症尤为相关，这两种基因就是HP1BP3和TTC9B。英国研究人员在该项试验发现，携带了这两种基因变体的女性分娩之后患上产后抑郁症的可能性更大，而且预测的准确率在80%以上。 这两个基因可能会让女性的海马区甲基化出现变化，海马区是大脑中与情绪紊乱相关的区域，它的变化可能导致产后抑郁。不过，海马区甲其化的变化不是自动发生的，它是受到了雌激素的刺激，这种雌激素，再加上孕酮，在产前剧增，产后又骤降。而在传统研究中，产后抑郁已确信与一些激素的下降休戚相关。这两种基因的功能正是与内分泌系统有关，可控制身体分泌一些影响情绪等功能的激素。所以不管从哪个角度看，HP1BP3和TTC9B这两种基因的特有变体似乎都是准妈妈有可能出现产后抑郁症的一个比较可信的预兆。 所以，这项最新的研究表明，产后抑郁的确跟基因有关，因此，产后抑郁是可以预测的。

qPCR检测，你需要知道这些

2019年1月3日，国内医药界人士的朋友圈被一则两家药企合并的重磅消息霸屏。主角之一，是来自苏州工业园区的一家领军人才企业--迈博斯生物医药（苏州）有限公司。苏州工业园区企业发展服务中心主办、参加学院承办的“卓越领袖培优赋能项目”学员、迈博斯生物创始人钱雪明博士回忆起这段经历时，感慨道：“我们在当时算开了个头。”

短短的一句话，分量却是沉甸甸的。从“0”到“1”，不仅是商业模式的革新，也是企业之间叠加优势资源，提升整体竞争力的创新之举，更体现了长三角一体化在区域合作、产业赋能领域是值得深入 探索 的一项重大工程。

迈博斯成立于2012年，基于其独有的免疫耐受屏障突破技术（IMTB），已建立起以肿瘤免疫治疗、骨科和肾病为重点的12个产品管线，这些年来不断赢得业内同行和投资人的高度关注。企业凭借清晰的项目规划、长远发展策略、领域内的强竞争力，8年的时间从初创团队的2人发展到现在超过300人，至今已完成3轮融资，2.37亿美元。合并之后，企业将拥有研究、开发、法规和生产的全流程整合能力。

今年的金鸡湖合伙人计划，迈博斯作为园区在生物医药领域的优质企业之一，被纳入进首批入库企业名单中，钱雪明博士也积极参与金鸡湖合伙人计划推出的赋能培训-领袖培优培训。对企业而言，实践新发展理念不仅要依靠创新驱动，更是离不开各方资源的对接合作，金鸡湖合伙人计划正是希望通过这个平台，帮助合伙人企业延伸新发展触角，个性化推动对接合作，加快打造具有世界影响力的园区企业与世界一流的营商环境。

曾在全球生物 科技 巨头安进公司任职首席科学家的钱雪明博士，隐藏着一颗谦逊、开放的心。他认为，一家具备长期运作能力的生物医药企业除了建立技术平台之外，最关键的还是要拥有一个优秀团队。反观招贤纳士，尖端人才也像是投资人，他们将自己生命中最辉煌的几年时间投入企业中，求的必然不止“钞票”和“期权”。这就要求企业和企业的领导者拥有吸引人才的特质。例如“项目是不是有价值、企业是不是有韧性、老板是不是专业、包容、有领导力……”。

钱雪明博士将自己归国后的头两年经历比作“打工人”，也曾为自己无法掌控的项目进度感到焦虑，但他始终认为保持最前沿技术的学术洞见和快速应变能力是维系企业“护城河”的关键。

在下面的访谈中，您将看到旅美20年的钱雪明博士对于生物医药行业发展趋势的解构和创业经验的分享。

受访者：钱雪明博士，迈博斯CEO、国家级重大人才引进工程专家、参加学院卓越领袖培优赋能项目学员

采访/撰稿：徐燕倩

站在“巨人”肩膀上的经验

Q1

美国生物医药行业起步较早，作为行业领军企业的前首席科学家，您当时看到了整个行业的哪些变化？

钱雪明： 从20世纪90年代末到2010年我回国，近20多年来，我在美国看到了这个行业的有趣变化。

首先是从研发小分子口服药到生物医药的起步。小分子药物往往是去抑制某种过剩的东西，做的是“减法”。而生物医药早期做的是“加法”，研究蛋白质，例如EPO。

在人类基因组没有完全破解之前，一些公司觉得做“加法”的药物靶标无限。直到90年代末期，科学家投入到了人类基因组计划中，在基因测序完成之后，新靶标不断涌现。但我们并没有在其中发现太多可直接用于研制蛋白质药物的靶标。于是，90年代末期，安进公司开始转型做“减法”，那时侧重于肿瘤领域的美国基因泰克公司已经走在“减法”前列，有赫赛汀、美罗华等经典药物面世。

2010年之后，美国生物医药行业又逐渐发生了较大变化，能够做“减法”的新靶标也越来越少，于是整个行业开始了follow-on药物的追逐。后来，美国默克与施贵宝研发出PD-1抑制剂类药物，肿瘤治疗格局骤然变革。此后，行业内又开始关注少部分病人对靶标能有较好应答的药物，例如FGFR、ADC等逐步细化、多样化的领域。

在行业变化的过程中，我们发现如果仅聚焦研发小分子药物，那么待药物专利期过后，企业销售额会经历断崖式下跌。为了平衡这一点，很多传统的制药公司开始大规模投入抗体药物。为了拓展更多的开发空间，以生物药为主线的安进却反其道而行，切入小分子药物领域。这种及时布局的做法，奠定了后来安进在KRAS药物赛道上的领导者地位。

我们可以看到行业中的巨头多样化布局，不断 探索 新的赛道，如细胞治疗、基因治疗领域。

Q2

安进公司的工作给你带来了什么？

钱雪明： 1997年9月22日，我加入了美国安进公司。当年，安进开始寻找、验证“减法”靶标，并研发了公司第一个以抗体为基础的药物Prolia（地舒单抗）。2010年Prolia获批上市，我也恰好在那一年离开了安进。

从制药工业流程来看，美国的生物医药起步早，安进是行业的领先者，而我所积累的生物制药工业的经验和想法，都是站在它的肩膀上了解到的——在职十多年，我看到了药物从立项到上市的整个过程。

研发抗体药物需要有诸多考量，建立技术平台很关键，每个环节所需要的技术都要了然于心。 对于安进来说，它能够基于过去“加法”药物的研发技术，进行快速转变。依托过去EPO的研发经验，安进运用相似的方法建立CHO工程细胞株，同时还要在放大、生产、纯化、制剂、罐装等每一个环节确保原料安全，以及对药物进行合理定价。

Q3

赛道是如何分化的？

钱雪明： 靶标在疾病中能起多大的作用很关键。而甄选靶标成为了各家公司的分化特征，所谓“各占几个山头”。例如，基因泰克专注肿瘤领域，成果包括阿瓦斯汀、阿替利珠单抗等；安进聚焦骨科和代谢疾病，成果包括地舒单抗、罗莫佐单抗等。

课堂讨论

“荒土”和“机遇”

Q4

回国后，是什么样的契机让你思考创业这件事的？

钱雪明： 2010年我随家属回国后，国内生物医药仍然是一片“荒土”。但换一个角度看，遍地都是机遇。

刚回国时，我找不到研发抗体新药的人。为了养家糊口，刚开始的两年，我来到北京盛诺基因“打工”，帮助建立研发团队。当公司项目进行到临床二期阶段时，我决定离开，因为想做自己的专长——first-in-class抗体药物研发。于是我从北京回到苏州，想着无论如何要建一个“小作坊”，迈博斯生物就这样诞生了。

我非常感谢苏州工业园区。园区有很棒的人才政策，让我得到了启动资金、购房补贴，这些对于刚起步的创业者来说，是莫大的帮助。基于这种帮助，我同几位朋友好说歹说拿到了第一笔天使投资，300万元，并且着手自建实验室、拿环保资质证书等。当时迈博斯的办公室只有350平方米，“每一块砖”都要自己设计，装修费用我记得非常清楚，27.4万元。

Q5

初创团队是如何起步的？

钱雪明： 起初，我的团队只有2个人，1名技术员、1名行政助理，财务是外包的。

公司创立6个月之后，我的团队就开始用自己的技术接项目了。因为技术需要用项目来验证，验证到一定阶段后，可以为技术做宣传，告诉大家我们研究的靶标做出了这么多有意思的抗体。如此之后，一些公司来问我们是否可以提供CRO服务，我们就能通过提供服务，外加政府提供的补助资金，把自己给养活。

2015年，我的团队很荣幸地得到了礼来亚洲基金的支持，并且开始与恒瑞医药合作。那一年的净利润超过了100万元，我的团队“活”了。

Q6

是什么契机让迈博斯改道生物制药，而不选择做一个CRO机构？

钱雪明： 那时药明康德已经发展得很好了。而事实上如果我不去融资，也可以转让手头正在进行的几个项目，能够变现几千万。但是我觉得也许CRO并不是我最擅长的——要养很多员工、辛苦得交付与合作伙伴对接。另一方面，当时国内外PD-1赛道大热，仅仅做CRO似乎显得“小打小闹”。

我并不是个墨守陈规的人，自以为有 探索 精神、好奇心强、喜欢去跟踪自己领域的最前沿，才能捕捉到机会。况且人类有2-3万个基因组，我们目前最多用了1000-2000个基因组，占总数不到10%，这意味着90%的“金矿”还没开采，抗体药物仍然大有可为。

而 我的目标是建一个技术平台，这个平台能够研发出有专利保护且成药性高的抗体药物。也就是说，只要某个基因被发现在某种疾病里起着重要的作用，这个平台有能力立即开发针对该靶标的抗体药物。

当时手头布局的项目，有一个是first-in-class，两个是fast-follow。但跟进型创新注重项目推进速度，而外包给其他CRO团队无法控制速度，并且上市后利润可能大打折扣。于是我就和擅长工艺、生产的奕安济世进行对接，如此一来研发、工艺、临床、生产就连成了整条线，成为了一个具有整合能力的平台。

Q7

就你设立的目标而言，建立这样的技术平台需要具备什么素质？

钱雪明： 要对最前沿的技术以及疾病领域非常敏感，关注生物学领域的学术动态，靶标要找对，这实际上是我们制药行业中非常重要的一点。

如果靶标没有找对，80%的几率会失败，即使最后药做到最好、质量最高、临床速度最快，都会变成无用功。当然有了对的靶标以后，成药后的市场份额又是需要讨论的另外一回事了。

300人团队如何建成

Q8

对于药物研发来说，招揽尖端人才相当重要，迈博斯从2人团队一直发展到超过300人团队，是怎么吸引人才的？

钱雪明：首先，是否能给人才相匹配的工资、回报；其次，企业需要有韧性和应变能力，不能随便“打退堂鼓”；第三，人才不仅看重工资回报，还需要实现自己价值和理想的平台和项目。

礼来亚洲基金也为我们带来了人才资源，例如我们的首席医学官徐莉博士、顾问苏岭博士等。而一个优秀的主要团队就会进一步吸引更多的工艺生产、临床领域的人才。

对于企业的掌舵者而言，也需要具备吸引人才的核心特质，才能够组建出优秀的团队。第一个特质是诚实，既明白自己所长，又要认识到自身的不足，这样才会知道什么样的人能够帮到自己；第二个特质是专业，必须在自己的领域有极专业的知识储备；第三个特质是开放的心态，掌舵者要能够听得进专业人士的意见，而且不能把自己的利益看得过重，请来的人才愿意在企业贡献自己生命中最辉煌的几年；第四个特质是领导力，这个包括要有魄力、建立药物管线的能力、组织能力、建设企业基础设施的能力等。

而优秀的团队才能够促使企业发展变得长久、有生机。

Q9

创业过程中，遇到过最难的事是什么？

钱雪明： 最难的时间在2017年。一个重要项目上，我花了钱请了外包团队，但对方没有按时给我应有的进度，而我的团队需要完成的事情已经做完了。我觉得很痛苦，因为这件事我无法控制，并且项目进行到一半，换掉与不换掉这样的CRO都会吃闷亏，因为拖延时间直接影响到药物研发的推进速度和最终价值，甚至影响下一轮融资，在生物医药的赛道上落后于人。

这件事情也促使了我与奕安济世合并，研发与工艺就好比我们的两条腿，其中一条腿被绑架，即使另一条腿想跑得快，也是不可能的。

生物学划分为两个时代：PCR前时代和PCR后时代，这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年，Kary B. Mullis提出了PCR技术的构想， 1985年，他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K. Saiki领衔发表，1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶，并将其应用于PCR反应，使PCR变得更加简单、易行和稳定，随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度，大致经历了以下三个阶段：（I）终点PCR：定性分析（II）定量PCR：相对定量（III）数字PCR：绝对定量

早期PCR主要用于定性分析，根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否，这种PCR可以称为终点PCR，在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年，Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定，这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下，这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR，那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年，罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文，介绍了将溴化乙锭（EB）用于PCR产物动态监控的方法，这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年，ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年，Wittwer等比较了（i）基于双链特异性染料SYBR Green I（ii）基于5’-核酸酶和双标探针（iii）基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般，人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量，不过本质上来说，qPCR只能用于相对定量，绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，产物浓度与起始浓度存在如下关系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始浓度，N T 代表终点浓度，n代表循环数），对公式两边取以对数可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常数e为底的对数），如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即qPCR中的荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系，这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素：（1）人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号，于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪；（2）不同的靶标基因的扩增效率不同，因此无法直接比较，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念），它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中，他们通过将DNA分子稀释到单拷贝，然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律，计算了靶标基因的分子数目，不过他们没有进一步发展该技术，很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制，另一方面受到检测仪器的限制，直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理；2001年，Livak KJ等介绍了2 - ∆∆ Ct 法的推导过程，局限性及应用。

当然这些原理很简单，即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增，当我们把终点的判断标准固定时，起始模板量高的样本最先到达，起始模板量低的样本消耗更多的循环数，并且每相差一个循环，代表起始浓度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。检测不同样本时， ∆ Ct可能受样本量差异的影响，因此引入了内参基因的校正。内参基因，也叫管家基因或者看家基因，一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达，那么两个样本内参基因的 ∆ Ct就代表了样本量的差异，靶标基因的 ∆ Ct – 内参基因的 ∆ Ct即为靶标基因的真实表达量差异，这就是2 - ∆∆ Ct 法。

但是有几个问题需要注意：（1）PCR并非全程都是指数增长期，比较必须在对数扩增期进行（2）一般默认对数增长期扩增效率是100%，这并不严谨，尤其是一些扩增困难的模板，效率可能与100%差异很大，纵向分析某基因的表达量（如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量）时，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能并不太准确（3）不同靶标基因的扩增效率是不同的，因此横向比较不同靶标基因时，可能造成较大的误差。

鉴于此，我们在设计引物时，应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近，从而保证相近的扩增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站，收录了大量物种的qPCR引物数据，具有一定参考价值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等对2 - ∆∆ Ct 法进行了一些校正，采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正，具有一定参考意义。

qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。（2）Simmonds等报道的方法，将DNA模板做极限稀释，一直到PCR体系中仅含有一个模板分子，此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型，在实际操作中很有困难，首先需要很多稀释梯度，其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数，如RNA分子数的精确测定，DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数，该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数，结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性，因此，他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。

拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品，质粒容易提取和纯化，因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度，精确测定其核酸浓度，根据公式：N = 6.02 × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数，式中N代表分子数目，M DNA 代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因，按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数，然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数，带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般，应该选择基因组上拷贝数较低，物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式，双标准曲线并不是必需的，如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法测量靶标基因的拷贝数，林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法，其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确，并且能够发现新基因型，是基因分型或SNP检测的金标准，但它比较慢，且操作比较繁琐。qPCR检测操作简单且速度极快，目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年，Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因，这种方法容易理解，假设已知SNP位点为A/T，如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型，3’-T引物产生终点信号为T基因型，两种引物均产生信号即为杂合型。1995年，Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法，这种方法中，分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针，并设置纯和基因型的对照，随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型，靠近B参照代表B基因型，如果位于A和B之间则为杂合型（如下图）。

2003年，Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法，这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物，A基因型设计正常长度的引物，B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，经过PCR扩增后，不同基因型产物的Tm就会发生变化，依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线，可以快速区分基因型。

1995年以后，qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长，成为分子生物学最热门的领域之一。近年来，随着分子诊断行业的崛起，qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时，也产生了一些问题，如判断标准不一致，检测精确度没有统一标准，RNA检测假阳性较严重等。2009年，多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的 MIQE指南 ，该指南规范了qPCR的常用术语，如Ct应称为Cq，RT-PCR应写作RT-qPCR等，并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求，此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成，共85个参数，以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份，但遵守这些规范能够让你的研究更易重复，也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注：指南的内容和附表可以在这里获取： http://rdml.org/miqe.html

参考文献

[1] Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985230(4732):1350‐1354. doi:10.1126/science.2999980

[2] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science. 1988239(4839):487‐491. doi:10.1126/science.2448875

[3] Simmonds P, Balfe P, Peutherer JF, et al. Human immunodeficiency virus-infected individuals contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low copy numbers. J Virol. 199064(2):864‐872.

[4] Simmonds P, Zhang LQ, Watson HG, et al. Hepatitis C quantification and sequencing in blood products, haemophiliacs, and drug users. Lancet. 1990336(8729):1469‐1472. doi:10.1016/0140-6736(90)93179-s

[5] Higuchi, R et al. “Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.” Bio/technology (Nature Publishing Company) vol. 10,4 (1992): 413-7. doi:10.1038/nbt0492-413

[6] Wittwer CT, Ririe KM, Andrew RV, et al. The LightCycler: a microvolume multisample fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques. 199722(1):176‐181. doi:10.2144/97221pf02

[7] Zachar V, Thomas RA, Goustin AS. Absolute quantification of target DNA: a simple competitive PCR for efficient analysis of multiple samples. Nucleic Acids Res. 199321(8):2017‐2018. doi:10.1093/nar/21.8.2017

[8] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 200125(4):402‐408. doi:10.1006/meth.2001.1262

[9] Pfaffl MW. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 200129(9):e45. doi:10.1093/nar/29.9.e45

[10] Rao X, Huang X, Zhou Z, Lin X. An improvement of the 2ˆ(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. Biostat Bioinforma Biomath. 20133(3):71‐85.

[11] Gilliland G, Perrin S, Blanchard K, Bunn HF. Analysis of cytokine mRNA and DNA: detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction. Proc Natl Acad Sci U S A. 199087(7):2725‐2729. doi:10.1073/pnas.87.7.2725

[12] Song P, Cai C, Skokut M, et al. Quantitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgene copy number in WHISKERS™-derived transgenic maize[J]. Plant Cell Reports, 2002, 20(10): 948-954. doi: 10.1007/s00299-001-0432-x

[13] 林维石等：利用实时荧光定量比较Ct法检测转基因小鼠外源基因拷贝数[J]. 生物技术通讯, 2013, 4(24): 497-500. doi: 10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.012

[14] Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB. Allele-specific enzymatic amplification of beta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 198986(8):2757‐2760. doi:10.1073/pnas.86.8.2757

[15] Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 198917(7):2503‐2516. doi:10.1093/nar/17.7.2503

[16] Huang MM, Arnheim N, Goodman MF. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 199220(17):4567‐4573. doi:10.1093/nar/20.17.4567

[17] Livak KJ, Marmaro J, Todd JA. Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nat Genet. 19959(4):341‐342. doi:10.1038/ng0495-341

[18] Landegren U, Nilsson M, Kwok P Y. Reading bits of genetic information: methods for single-nucleotide polymorphism analysis[J]. Genome research, 1998, 8(8): 769-776. doi:10.1101/gr.8.8.769

[19] Papp AC, Pinsonneault JK, Cooke G, Sadée W. Single nucleotide polymorphism genotyping using allele-specific PCR and fluorescence melting curves. Biotechniques. 200334(5):1068‐1072. doi:10.2144/03345dd03

以上就是关于spaltmann等提出判断一个基因是否适合作为抗菌靶标，其标准为什么全部的内容，如果了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！